Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com.Die von Ihnen verwendete Browserversion bietet eingeschränkte CSS-Unterstützung.Für die beste Erfahrung empfehlen wir, dass Sie einen aktualisierten Browser verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus in Internet Explorer deaktivieren).In der Zwischenzeit werden wir die Website ohne Stile und JavaScript rendern, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.
Genvektoren zur Behandlung von pulmonaler Mukoviszidose müssen auf die konduktiven Atemwege gerichtet sein, da die periphere Lungentransduktion keinen therapeutischen Effekt hat.Die Effizienz der viralen Transduktion steht in direktem Zusammenhang mit der Verweilzeit des Trägers.Abgabeflüssigkeiten wie Genträger diffundieren jedoch während der Inhalation auf natürliche Weise in die Alveolen, und therapeutische Partikel jeder Form werden schnell durch mukoziliären Transport entfernt.Die Verlängerung der Verweildauer von Genträgern im Respirationstrakt ist wichtig, aber schwer zu erreichen.Trägerkonjugierte magnetische Partikel, die auf die Oberfläche der Atemwege gerichtet werden können, können das regionale Targeting verbessern.Aufgrund von Problemen mit der In-vivo-Bildgebung ist das Verhalten solch kleiner magnetischer Partikel auf der Atemwegsoberfläche in Gegenwart eines angelegten Magnetfelds kaum bekannt.Das Ziel dieser Studie war es, Synchrotron-Bildgebung zu verwenden, um die Bewegung einer Reihe magnetischer Partikel in der Luftröhre von anästhesierten Ratten in vivo zu visualisieren, um die Dynamik und Verhaltensmuster von Einzel- und Massenpartikeln in vivo zu untersuchen.Wir bewerteten dann auch, ob die Abgabe von lentiviralen Magnetpartikeln in Gegenwart eines Magnetfelds die Effizienz der Transduktion in der Luftröhre der Ratte erhöhen würde.Synchrotron-Röntgenbildgebung zeigt das Verhalten magnetischer Partikel in stationären und bewegten Magnetfeldern in vitro und in vivo.Partikel können mit Magneten nicht einfach über die Oberfläche lebender Atemwege gezogen werden, aber während des Transports konzentrieren sich Ablagerungen im Sichtfeld, wo das Magnetfeld am stärksten ist.Die Transduktionseffizienz wurde auch um das Sechsfache erhöht, wenn lentivirale Magnetpartikel in Gegenwart eines Magnetfelds abgegeben wurden.Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass lentivirale Magnetpartikel und Magnetfelder wertvolle Ansätze zur Verbesserung des Genvektor-Targeting und der Transduktionsniveaus in den leitfähigen Atemwegen in vivo sein können.
Zystische Fibrose (CF) wird durch Variationen in einem einzigen Gen verursacht, das als CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) bezeichnet wird.Das CFTR-Protein ist ein Ionenkanal, der in vielen Epithelzellen im ganzen Körper vorhanden ist, einschließlich der Atemwege, einer Hauptstelle in der Pathogenese von Mukoviszidose.Defekte im CFTR führen zu abnormalem Wassertransport, Dehydrierung der Atemwegsoberfläche und einer verringerten Tiefe der Atemwegsoberflächenflüssigkeitsschicht (ASL).Es beeinträchtigt auch die Fähigkeit des mukoziliären Transportsystems (MCT), die Atemwege von eingeatmeten Partikeln und Krankheitserregern zu befreien.Unser Ziel ist es, eine lentivirale (LV) Gentherapie zu entwickeln, um die korrekte Kopie des CFTR-Gens zu liefern und ASL, MCT und Lungengesundheit zu verbessern, und die Entwicklung neuer Technologien fortzusetzen, die diese Parameter in vivo messen können1.
LV-Vektoren sind einer der führenden Kandidaten für die Mukoviszidose-Gentherapie, hauptsächlich weil sie das therapeutische Gen dauerhaft in Atemwegs-Basalzellen (Atemwegs-Stammzellen) integrieren können.Dies ist wichtig, da sie die normale Hydratation und Schleimbeseitigung wiederherstellen können, indem sie sich in funktionelle genkorrigierte Atemwegsoberflächenzellen differenzieren, die mit zystischer Fibrose assoziiert sind, was zu lebenslangen Vorteilen führt.LV-Vektoren müssen gegen die konduktiven Atemwege gerichtet sein, da hier die Lungenbeteiligung bei CF beginnt.Die Abgabe des Vektors tiefer in die Lunge kann zu einer alveolären Transduktion führen, aber dies hat keine therapeutische Wirkung bei zystischer Fibrose.Flüssigkeiten wie Genträger wandern jedoch auf natürliche Weise in die Alveolen, wenn sie nach der Geburt inhaliert werden3,4, und therapeutische Partikel werden durch MCTs schnell in die Mundhöhle ausgestoßen.Die Effizienz der LV-Transduktion steht in direktem Zusammenhang mit der Zeit, die der Vektor in der Nähe der Zielzellen verbleibt, um die zelluläre Aufnahme zu ermöglichen – die „Verweilzeit“ 5, die leicht durch einen typischen regionalen Luftstrom sowie eine koordinierte Aufnahme von Schleim und MCT-Partikeln verkürzt werden kann.Bei zystischer Fibrose ist die Möglichkeit, die LV-Verweildauer in den Atemwegen zu verlängern, wichtig, um in diesem Bereich ein hohes Transduktionsniveau zu erreichen, war bisher jedoch eine Herausforderung.
Um diese Hürde zu überwinden, schlagen wir vor, dass LV-Magnetpartikel (MPs) auf zwei komplementäre Weisen helfen können.Erstens können sie von einem Magneten zur Atemwegsoberfläche geführt werden, um das Targeting zu verbessern und Genträgerpartikeln dabei zu helfen, sich im richtigen Bereich der Atemwege zu befinden;und ASL) bewegen sich in Zellschicht 6. MPs werden häufig als zielgerichtete Arzneimitteltransportvehikel verwendet, wenn sie an Antikörper, Chemotherapeutika oder andere kleine Moleküle binden, die sich an Zellmembranen anheften oder an ihre jeweiligen Zelloberflächenrezeptoren binden und sich an Tumorstellen ansammeln in Vorhandensein von statischer Elektrizität.Magnetfelder für die Krebstherapie 7. Andere „hyperthermische“ Methoden zielen darauf ab, Tumorzellen abzutöten, indem MPs erhitzt werden, wenn sie oszillierenden Magnetfeldern ausgesetzt werden.Das Prinzip der magnetischen Transfektion, bei der ein Magnetfeld als Transfektionsmittel verwendet wird, um den Transfer von DNA in Zellen zu verbessern, wird häufig in vitro unter Verwendung einer Reihe von nicht-viralen und viralen Genvektoren für schwer zu transduzierende Zelllinien verwendet ..Die Effizienz der LV-Magnetotransfektion mit der Abgabe von LV MP in vitro in eine Zelllinie des menschlichen Bronchialepithels in Gegenwart eines statischen Magnetfelds wurde festgestellt, wodurch die Transduktionseffizienz um das 186-fache im Vergleich zum LV-Vektor allein erhöht wurde.LV MT wurde auch auf ein In-vitro-Modell der zystischen Fibrose angewendet, bei dem die magnetische Transfektion die LV-Transduktion in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen in Gegenwart von zystischer Fibrose-Sputum um den Faktor 20 erhöhte10.Allerdings hat die In-vivo-Organ-Magnetotransfektion relativ wenig Aufmerksamkeit erfahren und wurde nur in wenigen Tierstudien11,12,13,14,15, insbesondere in der Lunge, evaluiert16,17.Die Möglichkeiten der magnetischen Transfektion in der Lungentherapie bei Mukoviszidose sind jedoch klar.Tanet al.(2020) stellten fest, dass „eine Validierungsstudie zur effektiven pulmonalen Abgabe magnetischer Nanopartikel den Weg für zukünftige CFTR-Inhalationsstrategien ebnen wird, um die klinischen Ergebnisse bei Patienten mit zystischer Fibrose zu verbessern“6.
Das Verhalten kleiner magnetischer Partikel auf der Oberfläche der Atemwege in Gegenwart eines angelegten Magnetfelds ist schwer zu visualisieren und zu untersuchen, und daher sind sie kaum bekannt.In anderen Studien haben wir eine auf Synchrotronausbreitung basierende Phasenkontrast-Röntgenbildgebung (PB-PCXI)-Methode zur nicht-invasiven Bildgebung und Quantifizierung winziger in vivo-Änderungen der ASL18-Tiefe und des MCT19-Verhaltens20 entwickelt, um die Hydratation der Gaskanaloberfläche direkt zu messen und wird als Frühindikator für die Wirksamkeit der Behandlung verwendet.Darüber hinaus verwendet unsere MCT-Bewertungsmethode Partikel mit einem Durchmesser von 10–35 µm, die aus Aluminiumoxid oder Glas mit hohem Brechungsindex bestehen, als MCT-Marker, die mit PB-PCXI21 sichtbar sind.Beide Methoden eignen sich zur Abbildung einer Reihe von Partikeltypen, einschließlich MPs.
Aufgrund der hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung sind unsere PB-PCXI-basierten ASL- und MCT-Assays gut geeignet, um die Dynamik und Verhaltensmuster von Einzel- und Bulk-Partikeln in vivo zu untersuchen, um uns zu helfen, MP-Genabgabemethoden zu verstehen und zu optimieren.Der Ansatz, den wir hier verwenden, basiert auf unseren Studien mit der Strahllinie SPring-8 BL20B2, in denen wir die Flüssigkeitsbewegung nach Abgabe einer Dosis eines Dummy-Vektors in die nasalen und pulmonalen Atemwege von Mäusen visualisiert haben, um unsere beobachteten heterogenen Genexpressionsmuster zu erklären in unserem Gen.Tierversuche mit einer Trägerdosis von 3,4 .
Das Ziel dieser Studie war es, das PB-PCXI-Synchrotron zu verwenden, um in vivo Bewegungen einer Reihe von MPs in der Luftröhre lebender Ratten zu visualisieren.Diese PB-PCXI-Bildgebungsstudien wurden entwickelt, um die MP-Serie, die Magnetfeldstärke und den Ort zu testen, um ihre Wirkung auf die MP-Bewegung zu bestimmen.Wir gingen davon aus, dass ein externes Magnetfeld dem zugeführten MF helfen würde, im Zielgebiet zu bleiben oder sich dorthin zu bewegen.Diese Studien ermöglichten es uns auch, Magnetkonfigurationen zu bestimmen, die die Menge an Partikeln maximieren, die nach der Ablagerung in der Luftröhre verbleiben.In einer zweiten Studienreihe wollten wir diese optimale Konfiguration verwenden, um das Transduktionsmuster zu demonstrieren, das sich aus der In-vivo-Zufuhr von LV-MPs in die Atemwege von Ratten ergibt, unter der Annahme, dass die Lieferung von LV-MPs im Zusammenhang mit dem Zielen auf die Atemwege resultieren würde in erhöhter LV-Transduktionseffizienz..
Alle Tierversuche wurden gemäß den von der University of Adelaide (M-2019-060 und M-2020-022) und dem SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee genehmigten Protokollen durchgeführt.Die Experimente wurden gemäß den Empfehlungen von ARRIVE durchgeführt.
Alle Röntgenbilder wurden an der BL20XU-Beamline am SPring-8-Synchrotron in Japan mit einem ähnlichen Aufbau wie dem zuvor beschriebenen aufgenommen21,22.Kurz gesagt, die Experimentierbox befand sich 245 m vom Synchrotron-Speicherring entfernt.Ein Abstand von Probe zu Detektor von 0,6 m wird für Partikelbildgebungsstudien und 0,3 m für In-vivo-Bildgebungsstudien verwendet, um Phasenkontrasteffekte zu erzeugen.Es wurde ein monochromatischer Strahl mit einer Energie von 25 keV verwendet.Die Bilder wurden mit einem hochauflösenden Röntgenwandler (SPring-8 BM3) aufgenommen, der mit einem sCMOS-Detektor gekoppelt war.Der Wandler wandelt Röntgenstrahlen mithilfe eines 10 µm dicken Szintillators (Gd3Al2Ga3O12) in sichtbares Licht um, das dann mithilfe eines Mikroskopobjektivs ×10 (NA 0,3) auf den sCMOS-Sensor gerichtet wird.Der sCMOS-Detektor war ein Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mit einer Arraygröße von 2048 × 2048 Pixeln und einer Rohpixelgröße von 6,5 × 6,5 µm.Diese Einstellung ergibt eine effektive isotrope Pixelgröße von 0,51 µm und ein Sichtfeld von ungefähr 1,1 mm × 1,1 mm.Die Expositionsdauer von 100 ms wurde gewählt, um das Signal-Rausch-Verhältnis von magnetischen Partikeln innerhalb und außerhalb der Atemwege zu maximieren und gleichzeitig durch Atmung verursachte Bewegungsartefakte zu minimieren.Für In-vivo-Studien wurde ein schneller Röntgenverschluss in den Röntgenstrahlengang platziert, um die Strahlendosis zu begrenzen, indem der Röntgenstrahl zwischen den Aufnahmen blockiert wurde.
LV-Medien wurden in keiner SPring-8 PB-PCXI-Bildgebungsstudie verwendet, da die BL20XU-Bildgebungskammer nicht nach Biosafety Level 2 zertifiziert ist.Stattdessen haben wir eine Reihe gut charakterisierter MPs von zwei kommerziellen Anbietern ausgewählt, die eine Reihe von Größen, Materialien, Eisenkonzentrationen und Anwendungen abdecken, — zunächst, um zu verstehen, wie Magnetfelder die Bewegung von MPs in Glaskapillaren und dann in Glaskapillaren beeinflussen lebende Atemwege.auftauchen.Die Größe der MP variiert von 0,25 bis 18 µm und besteht aus verschiedenen Materialien (siehe Tabelle 1), aber die Zusammensetzung jeder Probe, einschließlich der Größe der magnetischen Partikel in der MP, ist unbekannt.Basierend auf unseren umfangreichen MCT-Studien 19, 20, 21, 23, 24 erwarten wir, dass MPs bis zu 5 µm auf der Luftröhrenoberfläche zu sehen sind, beispielsweise durch Subtrahieren aufeinanderfolgender Frames, um eine verbesserte Sichtbarkeit der MP-Bewegung zu sehen.Ein einzelner MP von 0,25 µm ist kleiner als die Auflösung des Bildgebungsgeräts, aber PB-PCXI soll ihren volumetrischen Kontrast und die Bewegung der Oberflächenflüssigkeit, auf der sie abgelagert sind, nach dem Ablagern erkennen.
Proben für jeden MP in der Tabelle.1 wurde in 20 &mgr;l Glaskapillaren (Drummond Microcaps, PA, USA) mit einem Innendurchmesser von 0,63 mm hergestellt.Korpuskuläre Partikel sind in Wasser erhältlich, während CombiMag-Partikel in der proprietären Flüssigkeit des Herstellers erhältlich sind.Jedes Röhrchen wird zur Hälfte mit Flüssigkeit gefüllt (ca. 11 µl) und auf den Probenhalter gestellt (siehe Abbildung 1).Die Glaskapillaren wurden jeweils horizontal auf dem Tisch in der Abbildungskammer platziert und an den Rändern der Flüssigkeit positioniert.Ein Nickelschalenmagnet mit 19 mm Durchmesser (28 mm Länge) aus seltenen Erden, Neodym, Eisen und Bor (NdFeB) (N35, Kat.-Nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) mit einer Remanenz von 1,17 T wurde an a befestigt Separater Übertragungstisch, um Ihre Position während des Renderns aus der Ferne zu ändern.Die Röntgenbildgebung beginnt, wenn der Magnet etwa 30 mm über der Probe positioniert ist und Bilder mit 4 Bildern pro Sekunde erfasst werden.Während der Bildgebung wurde der Magnet in die Nähe des Glaskapillarröhrchens gebracht (in einem Abstand von etwa 1 mm) und dann entlang des Röhrchens bewegt, um den Effekt von Feldstärke und Position zu beurteilen.
Ein In-vitro-Bildgebungsaufbau mit MP-Proben in Glaskapillaren im Stadium der Translation der xy-Probe.Der Weg des Röntgenstrahls ist mit einer roten Punktlinie markiert.
Sobald die In-vitro-Sichtbarkeit von MPs etabliert war, wurde eine Untergruppe von ihnen in vivo an weiblichen Wildtyp-Wistar-Albino-Ratten (ca. 12 Wochen alt, ca. 200 g) getestet.Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), Midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) und Butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ratten wurden mit einer Mischung von Pharma (Japan) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert.Nach der Anästhesie wurden sie für die Bildgebung vorbereitet, indem das Fell um die Luftröhre entfernt, ein Endotrachealtubus (ET; 16 Ga intravenöse Kanüle, Terumo BCT) eingeführt und sie in Rückenlage auf einer speziell angefertigten Speicherfolie mit Thermobeutel immobilisiert wurden um die Körpertemperatur zu halten.22. Die Bildgebungsplatte wurde dann in einem leichten Winkel am Probentisch in der Bildgebungsbox befestigt, um die Trachea horizontal auf dem Röntgenbild auszurichten, wie in Abbildung 2a gezeigt.
(a) In-vivo-Bildgebungsaufbau in der SPring-8-Bildgebungseinheit, Röntgenstrahlengang mit roter gestrichelter Linie markiert.(b,c) Trachealmagnetlokalisierung wurde aus der Ferne mit zwei orthogonal montierten IP-Kameras durchgeführt.Auf der linken Seite des Bildes auf dem Bildschirm sehen Sie die Drahtschlaufe, die den Kopf hält, und die im ET-Tubus installierte Einführkanüle.
Ein ferngesteuertes Spritzenpumpensystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) unter Verwendung einer 100-&mgr;l-Glasspritze wurde unter Verwendung einer 30-Ga-Nadel mit einem PE10-Schlauch (0,61 mm Außendurchmesser, 0,28 mm Innendurchmesser) verbunden.Markieren Sie den Tubus, um sicherzustellen, dass sich die Spitze beim Einführen des Endotrachealtubus in der richtigen Position in der Trachea befindet.Unter Verwendung einer Mikropumpe wurde der Spritzenkolben entfernt und die Spitze des Röhrchens in die abzugebende MP-Probe eingetaucht.Der beladene Zufuhrschlauch wurde dann in den Endotrachealtubus eingeführt, wobei die Spitze am stärksten Teil unseres erwarteten angelegten Magnetfelds platziert wurde.Die Bildaufnahme wurde mit einem Atemdetektor gesteuert, der mit unserer Arduino-basierten Timing-Box verbunden war, und alle Signale (z. B. Temperatur, Atmung, Verschluss öffnen/schließen und Bildaufnahme) wurden mit Powerlab und LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) aufgezeichnet. 22 Bei der Bildgebung Als das Gehäuse nicht verfügbar war, wurden zwei IP-Kameras (Panasonic BB-SC382) etwa im 90°-Winkel zueinander positioniert und zur Kontrolle der Position des Magneten relativ zur Trachea während der Bildgebung verwendet (Abbildung 2b, c).Um Bewegungsartefakte zu minimieren, wurde während des terminalen Atemflussplateaus ein Bild pro Atemzug aufgenommen.
Der Magnet ist an der zweiten Stufe angebracht, die entfernt an der Außenseite des Abbildungskörpers angeordnet sein kann.Es wurden verschiedene Positionen und Konfigurationen des Magneten getestet, einschließlich: platziert in einem Winkel von ungefähr 30° über der Trachea (Konfigurationen sind in den 2a und 3a gezeigt);ein Magnet über dem Tier und der andere darunter, wobei die Pole auf Anziehung eingestellt sind (Abbildung 3b)., ein Magnet über dem Tier und einer darunter, wobei die Pole auf Abstoßung eingestellt sind (Abbildung 3c), und ein Magnet über und senkrecht zur Luftröhre (Abbildung 3d).Nachdem Sie das Tier und den Magneten eingerichtet und das zu testende MP in die Spritzenpumpe geladen haben, geben Sie bei der Aufnahme von Bildern eine Dosis von 50 ul mit einer Geschwindigkeit von 4 ul/s ab.Der Magnet wird dann entlang oder über der Trachea hin und her bewegt, während weiterhin Bilder aufgenommen werden.
Magnetkonfiguration für die In-vivo-Bildgebung (a) ein Magnet über der Luftröhre in einem Winkel von ungefähr 30°, (b) zwei Magnete, die für Anziehung konfiguriert sind, (c) zwei Magnete, die für Abstoßung konfiguriert sind, (d) ein Magnet über und senkrecht dazu Luftröhre.Der Beobachter blickte durch die Luftröhre vom Mund zu den Lungen hinunter, und der Röntgenstrahl passierte die linke Seite der Ratte und trat auf der rechten Seite aus.Der Magnet wird entweder entlang der Atemwege oder links und rechts über der Luftröhre in Richtung des Röntgenstrahls bewegt.
Wir versuchten auch, die Sichtbarkeit und das Verhalten von Partikeln in den Atemwegen ohne Vermischung von Atmung und Herzfrequenz zu bestimmen.Daher wurden die Tiere am Ende des Bildgebungszeitraums aufgrund einer Pentobarbital-Überdosis (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip) human eingeschläfert.Einige Tiere wurden auf der Bildgebungsplattform belassen, und nach dem Aufhören von Atmung und Herzschlag wurde der Bildgebungsprozess wiederholt, wobei eine zusätzliche Dosis MP hinzugefügt wurde, wenn kein MP auf der Atemwegsoberfläche sichtbar war.
Die resultierenden Bilder wurden für Flach- und Dunkelfeld korrigiert und dann unter Verwendung eines benutzerdefinierten Skripts, das in MATLAB (R2020a, The Mathworks) geschrieben wurde, zu einem Film zusammengesetzt (20 Bilder pro Sekunde; 15–25 × normale Geschwindigkeit, abhängig von der Atemfrequenz).
Alle Studien zur Übertragung von LV-Genvektoren wurden am Labortierforschungszentrum der University of Adelaide durchgeführt und zielten darauf ab, anhand der Ergebnisse des SPring-8-Experiments zu beurteilen, ob die Übertragung von LV-MP in Gegenwart eines Magnetfelds den Gentransfer in vivo verbessern könnte .Um die Auswirkungen von MF und Magnetfeld zu bewerten, wurden zwei Tiergruppen behandelt: Einer Gruppe wurde LV MF mit Magnetplatzierung injiziert, und der anderen Gruppe wurde einer Kontrollgruppe LV MF ohne Magnet injiziert.
LV-Genvektoren wurden unter Verwendung zuvor beschriebener Verfahren 25, 26 erzeugt.Der LacZ-Vektor exprimiert ein nukleär lokalisiertes Beta-Galactosidase-Gen, das vom konstitutiven MPSV-Promotor (LV-LacZ) gesteuert wird, der in transduzierten Zellen ein blaues Reaktionsprodukt produziert, das auf Fronten und Schnitten von Lungengewebe sichtbar ist.Die Titration wurde in Zellkulturen durch manuelles Zählen der Anzahl von LacZ-positiven Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers durchgeführt, um den Titer in TU/ml zu berechnen.Die Träger werden bei -80 °C kryokonserviert, vor der Verwendung aufgetaut und vor der Lieferung durch Mischen im Verhältnis 1:1 und Inkubieren auf Eis für mindestens 30 Minuten an CombiMag gebunden.
Normale Sprague-Dawley-Ratten (n = 3/Gruppe, ~2–3 ip anästhesiert mit einer Mischung aus 0,4 mg/kg Medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) und 60 mg/kg Ketamin (Ilium, Australien) im Alter von 1 Monat) ip ) Injektion und nicht-chirurgische orale Kanülierung mit einer 16 Ga intravenösen Kanüle.Um sicherzustellen, dass tracheales Atemwegsgewebe eine LV-Transduktion erhält, wurde es unter Verwendung unseres zuvor beschriebenen mechanischen Perturbationsprotokolls konditioniert, bei dem die tracheale Atemwegsoberfläche axial mit einem Drahtkorb (N-Circle, Nitinol-Steinextraktor ohne Spitze NTSE-022115)-UDH gerieben wurde. Cook Medical, USA) 30 S. 28.Dann, etwa 10 Minuten nach der Störung in der Biosicherheitswerkbank, wurde eine tracheale Verabreichung von LV-MP durchgeführt.
Das in diesem Experiment verwendete Magnetfeld wurde ähnlich wie bei einer In-vivo-Röntgenuntersuchung konfiguriert, wobei die gleichen Magnete mit Destillationsstentklemmen über der Luftröhre gehalten wurden (Abbildung 4).Ein Volumen von 50 &mgr;l (2 × 25 &mgr;l Aliquots) von LV-MP wurde in die Trachea (n = 3 Tiere) unter Verwendung einer Pipette mit Gelspitze, wie zuvor beschrieben, eingebracht.Die Kontrollgruppe (n = 3 Tiere) erhielt das gleiche LV-MP ohne Verwendung eines Magneten.Nach Beendigung der Infusion wird die Kanüle vom Endotrachealtubus entfernt und das Tier extubiert.Der Magnet bleibt 10 Minuten an Ort und Stelle, bevor er entfernt wird.Ratten wurde subkutan Meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australien) verabreicht, gefolgt von einem Anästhesieentzug durch intraperitoneale Injektion von 1 mg/kg Atipamazolhydrochlorid (Antisedan, Zoetis, Australien).Die Ratten wurden warm gehalten und bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie beobachtet.
LV-MP-Verabreichungsvorrichtung in einer biologischen Sicherheitswerkbank.Sie sehen, dass die hellgraue Luer-Lock-Hülse des ET-Tubus aus dem Mund herausragt und die in der Abbildung gezeigte Gel-Pipettenspitze durch den ET-Tubus bis zur gewünschten Tiefe in die Trachea eingeführt wird.
Eine Woche nach dem LV-MP-Verabreichungsverfahren wurden die Tiere human durch Inhalation von 100 % CO 2 getötet und die LacZ-Expression wurde unter Verwendung unserer Standard-X-Gal-Behandlung bewertet.Die drei am weitesten kaudal gelegenen Knorpelringe wurden entfernt, um sicherzustellen, dass mechanische Beschädigungen oder Flüssigkeitsretention aufgrund der Platzierung des Endotrachealtubus nicht in die Analyse einbezogen werden.Jede Luftröhre wurde der Länge nach aufgeschnitten, um zwei Hälften für die Analyse zu erhalten, und unter Verwendung einer Minutien-Nadel (Fine Science Tools) in einen Becher gegeben, der Silikonkautschuk (Sylgard, Dow Inc.) enthielt, um die Lumenoberfläche sichtbar zu machen.Die Verteilung und der Charakter der transduzierten Zellen wurden durch frontale Fotografie unter Verwendung eines Nikon-Mikroskops (SMZ1500) mit einer DigiLite-Kamera und TCapture-Software (Tucsen Photonics, China) bestätigt.Die Bilder wurden mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen (einschließlich der maximalen Einstellung für die volle Breite der Luftröhre), wobei die gesamte Länge der Luftröhre Schritt für Schritt angezeigt wurde, wobei eine ausreichende Überlappung zwischen den einzelnen Bildern bereitgestellt wurde, um ein „Zusammenfügen“ der Bilder zu ermöglichen.Die Bilder von jeder Trachea wurden dann unter Verwendung des Composite Image Editor Version 2.0.3 (Microsoft Research) unter Verwendung des Planar-Motion-Algorithmus zu einem einzigen zusammengesetzten Bild kombiniert. Der Bereich der LacZ-Expression innerhalb der trachealen zusammengesetzten Bilder von jedem Tier wurde unter Verwendung eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben28 unter Verwendung von Einstellungen von 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Wert < 0,7 quantifiziert. Der Bereich der LacZ-Expression innerhalb der trachealen zusammengesetzten Bilder von jedem Tier wurde unter Verwendung eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben28 unter Verwendung von Einstellungen von 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Wert < 0,7 quantifiziert. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Der Bereich der LacZ-Expression in zusammengesetzten Luftröhrenbildern von jedem Tier wurde unter Verwendung eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben28 unter Verwendung von Einstellungen von 0,35 quantifiziert0,15 und Wert < 0,7.如 前所 述 ， 使用 自动 matlab 脚本 （r2020a ， mathWorks） 来自 来自 只 动物 动物 的 气管 复合 图像 中 的 lacz 表达 区域 进行 量化 ， 使用 使用 使用 设置 设置 设置。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 色调 色调 色调 色调 色调 色调 色调 色调 <0,58 、如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 .................... HÜFTE Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Bereiche der LacZ-Expression auf zusammengesetzten Bildern der Luftröhre jedes Tieres wurden unter Verwendung eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben unter Verwendung von Einstellungen von 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Wert < 0,7 quantifiziert.Durch die Verfolgung von Gewebekonturen in GIMP v2.10.24 wurde für jedes zusammengesetzte Bild manuell eine Maske erstellt, um den Gewebebereich zu identifizieren und falsche Erkennungen außerhalb des Luftröhrengewebes zu verhindern.Die gefärbten Bereiche aus allen zusammengesetzten Bildern von jedem Tier wurden summiert, um den gesamten gefärbten Bereich für dieses Tier zu ergeben.Die bemalte Fläche wurde dann durch die Gesamtfläche der Maske geteilt, um eine normalisierte Fläche zu erhalten.
Jede Luftröhre wurde in Paraffin eingebettet und 5 um dick geschnitten.Die Schnitte wurden 5 Minuten lang mit neutralem Echtrot gegengefärbt, und die Bilder wurden unter Verwendung eines Nikon Eclipse E400-Mikroskops, einer DS-Fi3-Kamera und einer NIS-Elementerfassungssoftware (Version 5.20.00) erfasst.
Alle statistischen Analysen wurden in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) durchgeführt.Die statistische Signifikanz wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt.Die Normalität wurde unter Verwendung des Shapiro-Wilk-Tests getestet und Unterschiede in der LacZ-Färbung wurden unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests bewertet.
Die sechs in Tabelle 1 beschriebenen MPs wurden mit PCXI untersucht, und die Sichtbarkeit ist in Tabelle 2 beschrieben. Zwei Polystyrol-MPs (MP1 und MP2; 18 µm bzw. 0,25 µm) waren mit PCXI nicht sichtbar, aber die verbleibenden Proben konnten identifiziert werden (Beispiele sind in Abbildung 5 dargestellt).MP3 und MP4 sind schwach sichtbar (10-15 % Fe3O4; 0,25 µm bzw. 0,9 µm).Obwohl MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) einige der kleinsten getesteten Partikel enthielt, war es am ausgeprägtesten.Das Produkt CombiMag MP6 ist schwer zu unterscheiden.In allen Fällen wurde unsere Fähigkeit, MFs zu erkennen, stark verbessert, indem der Magnet parallel zur Kapillare vor und zurück bewegt wurde.Als sich die Magnete von der Kapillare entfernten, wurden die Partikel in langen Ketten herausgezogen, aber als sich die Magnete näherten und die Magnetfeldstärke zunahm, verkürzten sich die Partikelketten, als die Partikel zur oberen Oberfläche der Kapillare wanderten (siehe Zusatzvideo S1 : MP4), Erhöhung der Partikeldichte an der Oberfläche.Umgekehrt nimmt die Feldstärke ab, wenn der Magnet aus der Kapillare entfernt wird, und die MPs ordnen sich zu langen Ketten neu an, die sich von der oberen Oberfläche der Kapillare aus erstrecken (siehe Zusatzvideo S2: MP4).Nachdem der Magnet aufgehört hat sich zu bewegen, bewegen sich die Partikel noch einige Zeit weiter, nachdem sie die Gleichgewichtsposition erreicht haben.Wenn sich der MP auf die obere Oberfläche der Kapillare zu und von ihr weg bewegt, neigen die magnetischen Teilchen dazu, Schmutz durch die Flüssigkeit zu ziehen.
Die Sichtbarkeit von MP unter PCXI variiert beträchtlich zwischen den Proben.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6.Alle hier gezeigten Bilder wurden mit einem etwa 10 mm direkt über der Kapillare positionierten Magneten aufgenommen.Die sichtbaren großen Kreise sind Luftblasen, die in den Kapillaren eingeschlossen sind und deutlich die schwarzen und weißen Randmerkmale des Phasenkontrastbildes zeigen.Das rote Kästchen zeigt die Vergrößerung an, die den Kontrast verstärkt.Beachten Sie, dass die Durchmesser der Magnetkreise in allen Figuren nicht maßstabsgetreu sind und ungefähr 100-mal größer als gezeigt sind.
Wenn sich der Magnet entlang der Oberseite der Kapillare nach links und rechts bewegt, ändert sich der Winkel der MP-Schnur, um sich mit dem Magneten auszurichten (siehe Abbildung 6), wodurch die Magnetfeldlinien abgegrenzt werden.Nachdem die Sehne bei MP3-5 den Schwellenwinkel erreicht hat, schleifen die Partikel entlang der oberen Oberfläche der Kapillare.Dies führt häufig dazu, dass sich MPs in größeren Gruppen in der Nähe des stärksten Magnetfelds zusammenschließen (siehe Zusatzvideo S3: MP5).Dies wird auch besonders deutlich, wenn nahe am Ende der Kapillare abgebildet wird, wodurch das MP aggregiert und sich an der Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche konzentriert.Die Partikel im MP6, die schwerer zu unterscheiden waren als die im MP3-5, zogen nicht, wenn sich der Magnet entlang der Kapillare bewegte, aber die MP-Strings dissoziierten und ließen die Partikel sichtbar (siehe Zusatzvideo S4: MP6).In einigen Fällen, wenn das angelegte Magnetfeld reduziert wurde, indem der Magnet eine große Entfernung von der Bildgebungsstelle entfernt wurde, sanken alle verbleibenden MPs langsam durch die Schwerkraft zur unteren Oberfläche des Röhrchens und blieben in der Schnur (siehe Zusatzvideo S5: MP3). .
Der Winkel der MP-Schnur ändert sich, wenn sich der Magnet nach rechts über die Kapillare bewegt.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6.Das rote Kästchen zeigt die Vergrößerung an, die den Kontrast verstärkt.Bitte beachten Sie, dass die zusätzlichen Videos zu Informationszwecken dienen, da sie wichtige Partikelstrukturen und dynamische Informationen offenbaren, die in diesen statischen Bildern nicht visualisiert werden können.
Unsere Tests haben gezeigt, dass das langsame Vor- und Zurückbewegen des Magneten entlang der Luftröhre die Visualisierung des MF im Kontext komplexer Bewegungen in vivo erleichtert.Es wurden keine In-vivo-Tests durchgeführt, da die Polystyrolkügelchen (MP1 und MP2) in der Kapillare nicht sichtbar waren.Jeder der verbleibenden vier MFs wurde in vivo getestet, wobei die Längsachse des Magneten in einem Winkel von etwa 30° zur Vertikalen über der Luftröhre positioniert war (siehe Abbildungen 2b und 3a), da dies zu längeren MF-Ketten führte und effektiver war als ein Magnet..Konfiguration beendet.MP3, MP4 und MP6 wurden in der Luftröhre von lebenden Tieren nicht gefunden.Bei der Sichtbarmachung der Atemwege von Ratten nach humaner Tötung der Tiere blieben die Partikel unsichtbar, selbst wenn zusätzliches Volumen mit einer Spritzenpumpe hinzugefügt wurde.MP5 hatte den höchsten Eisenoxidgehalt und war das einzige sichtbare Partikel, daher wurde es zur Bewertung und Charakterisierung des MP-Verhaltens in vivo verwendet.
Die Platzierung des Magneten über der Luftröhre während der MF-Einführung führte dazu, dass viele, aber nicht alle MFs im Sichtfeld konzentriert wurden.Der tracheale Eintritt von Partikeln lässt sich am besten bei human eingeschläferten Tieren beobachten.Abbildung 7 und ergänzendes Video S6: MP5 zeigt eine schnelle magnetische Erfassung und Ausrichtung von Partikeln auf der Oberfläche der ventralen Luftröhre, was darauf hinweist, dass MPs auf gewünschte Bereiche der Luftröhre gerichtet werden können.Bei der Suche weiter distal entlang der Trachea nach der MF-Verabreichung wurden einige MFs näher an der Karina gefunden, was auf eine unzureichende Magnetfeldstärke hinweist, um alle MFs zu sammeln und zu halten, da sie während der Flüssigkeitsverabreichung durch den Bereich der maximalen Magnetfeldstärke abgegeben wurden.Prozess.Die postnatalen MP-Konzentrationen waren jedoch um den Bildbereich herum höher, was darauf hindeutet, dass viele MPs in Atemwegsregionen verblieben, in denen die angelegte Magnetfeldstärke am höchsten war.
Bilder von (a) vor und (b) nach der Abgabe von MP5 in die Luftröhre einer kürzlich eingeschläferten Ratte mit einem Magneten, der direkt über dem Bildgebungsbereich platziert wurde.Der abgebildete Bereich befindet sich zwischen zwei Knorpelringen.Vor Abgabe des MP befindet sich etwas Flüssigkeit in den Atemwegen.Das rote Kästchen zeigt die Vergrößerung an, die den Kontrast verstärkt.Diese Bilder stammen aus dem Video in S6: MP5 Supplementary Video.
Das Bewegen des Magneten entlang der Trachea in vivo führte zu einer Änderung des Winkels der MP-Kette auf der Atemwegsoberfläche, ähnlich wie bei Kapillaren (siehe Abbildung 8 und Zusatzvideo S7: MP5).In unserer Studie konnten MPs jedoch nicht über die Oberfläche lebender Atemwege gezogen werden, wie es Kapillaren tun könnten.In einigen Fällen verlängert sich die MP-Kette, wenn sich der Magnet nach links und rechts bewegt.Interessanterweise fanden wir auch heraus, dass die Partikelkette die Tiefe der Oberflächenschicht der Flüssigkeit verändert, wenn der Magnet längs entlang der Trachea bewegt wird, und sich ausdehnt, wenn der Magnet direkt über Kopf bewegt und die Partikelkette in eine vertikale Position gedreht wird (vgl Zusatzvideo S7).: MP5 bei 0:09, unten rechts).Das charakteristische Bewegungsmuster änderte sich, wenn der Magnet seitlich über die Oberseite der Luftröhre bewegt wurde (dh zur linken oder rechten Seite des Tieres, anstatt entlang der Länge der Luftröhre).Die Partikel waren während ihrer Bewegung noch deutlich sichtbar, aber als der Magnet von der Luftröhre entfernt wurde, wurden die Spitzen der Partikelstränge sichtbar (siehe Zusatzvideo S8: MP5, ab 0:08).Dies stimmt mit dem beobachteten Verhalten des Magnetfeldes unter Einwirkung eines angelegten Magnetfeldes in einer Glaskapillare überein.
Beispielbilder, die MP5 in der Luftröhre einer lebenden anästhesierten Ratte zeigen.(a) Der Magnet wird verwendet, um Bilder über und links von der Luftröhre aufzunehmen, dann (b) nachdem der Magnet nach rechts bewegt wurde.Das rote Kästchen zeigt die Vergrößerung an, die den Kontrast verstärkt.Diese Bilder stammen aus dem Video, das im Zusatzvideo von S7 zu sehen ist: MP5.
Wenn die beiden Pole in einer Nord-Süd-Ausrichtung über und unter der Trachea gestimmt wurden (dh anziehend; Abb. 3b), erschienen die MP-Sehnen länger und befanden sich eher an der Seitenwand der Trachea als an der dorsalen Oberfläche der Luftröhre (siehe Anhang).Video S9:MP5).Allerdings wurden hohe Konzentrationen von Partikeln an einer Stelle (dh der dorsalen Oberfläche der Trachea) nach Flüssigkeitsverabreichung unter Verwendung eines Doppelmagnetgeräts nicht festgestellt, was normalerweise bei einem Einzelmagnetgerät auftritt.Wenn dann ein Magnet so konfiguriert wurde, dass er entgegengesetzte Pole abstößt (Abbildung 3c), stieg die Anzahl der im Sichtfeld sichtbaren Partikel nach der Abgabe nicht an.Die Einrichtung beider Magnetkonfigurationen ist aufgrund der hohen Magnetfeldstärke, die die Magnete anzieht bzw. drückt, eine Herausforderung.Der Aufbau wurde dann auf einen einzelnen Magneten geändert, der parallel zu den Atemwegen verläuft, aber in einem Winkel von 90 Grad durch die Atemwege verläuft, sodass die Kraftlinien die Luftröhrenwand orthogonal kreuzen (Abbildung 3d), eine Ausrichtung, die die Möglichkeit einer Partikelaggregation bestimmen soll an die Seitenwand.untersucht werden.In dieser Konfiguration gab es jedoch keine identifizierbare MF-Ansammlungsbewegung oder Magnetbewegung.Basierend auf all diesen Ergebnissen wurde eine Konfiguration mit einem einzelnen Magneten und einer 30-Grad-Ausrichtung für In-vivo-Studien von Genträgern gewählt (Abb. 3a).
Als das Tier unmittelbar nach seiner humanen Tötung mehrmals abgebildet wurde, bedeutete das Fehlen störender Gewebebewegungen, dass feinere, kürzere Partikellinien im klaren interknorpeligen Feld erkannt werden konnten, die entsprechend der Translationsbewegung des Magneten „schwankten“.deutlich das Vorhandensein und die Bewegung von MP6-Partikeln sehen.
Der Titer von LV-LacZ betrug 1,8 x 108 IE/ml, und nach Mischen im Verhältnis 1:1 mit CombiMag MP (MP6) wurden den Tieren 50 ul einer trachealen Dosis von 9 x 107 IE/ml LV-Vehikel (d. h. 4,5 x 106 TU/Ratte).).).Anstatt den Magneten während der Wehen zu bewegen, fixierten wir in diesen Studien den Magneten in einer Position, um festzustellen, ob die LV-Transduktion (a) im Vergleich zur Vektorabgabe in Abwesenheit eines Magnetfelds verbessert werden könnte und (b) ob die Atemwege dies könnten sei konzentriert.Die Zellen werden in die magnetischen Zielgebiete der oberen Atemwege transduziert.
Das Vorhandensein von Magneten und die Verwendung von CombiMag in Kombination mit LV-Vektoren schienen die Tiergesundheit nicht nachteilig zu beeinflussen, wie dies bei unserem Standardprotokoll für die LV-Vektorübertragung der Fall war.Frontale Bilder der Trachealregion, die mechanischer Störung ausgesetzt war (ergänzende Abb. 1), zeigten, dass die mit LV-MP behandelte Gruppe in Gegenwart eines Magneten signifikant höhere Transduktionsniveaus aufwies (Abb. 9a).In der Kontrollgruppe war nur eine geringe Menge an blauer LacZ-Färbung vorhanden (Abbildung 9b).Die Quantifizierung von X-Gal-gefärbten normalisierten Regionen zeigte, dass die Verabreichung von LV-MP in Gegenwart eines Magnetfelds zu einer etwa 6-fachen Verbesserung führte (Fig. 9c).
Beispiel für zusammengesetzte Bilder, die Trachealtransduktion mit LV-MP (a) in Gegenwart eines Magnetfelds und (b) in Abwesenheit eines Magneten zeigen.(c) Statistisch signifikante Verbesserung des normalisierten Bereichs der LacZ-Transduktion in der Trachea bei Verwendung eines Magneten (*p = 0,029, t-Test, n = 3 pro Gruppe, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts).
Neutrale, schnell rot gefärbte Schnitte (Beispiel in ergänzender Abb. 2) zeigten an, dass LacZ-gefärbte Zellen in derselben Probe und an derselben Stelle wie zuvor berichtet vorhanden waren.
Die größte Herausforderung bei der Gentherapie der Atemwege bleibt die genaue Lokalisierung von Trägerpartikeln in interessierenden Bereichen und das Erreichen einer hohen Transduktionseffizienz in der beweglichen Lunge bei Vorhandensein von Luftstrom und aktiver Schleimentfernung.Für LV-Träger, die zur Behandlung von Atemwegserkrankungen bei zystischer Fibrose bestimmt sind, war die Erhöhung der Verweilzeit der Trägerpartikel in den leitfähigen Atemwegen bisher ein unerreichbares Ziel.Wie von Castellani et.und möglicherweise eine niedrigere Dosis von Vehikel10.Die in vivo-Ablagerung und das Verhalten magnetischer Partikel in den Atemwegen unter dem Einfluss externer magnetischer Kräfte wurde jedoch nie beschrieben, und tatsächlich wurde die Fähigkeit dieses Verfahrens, die Genexpressionsniveaus in intakten lebenden Atemwegen zu erhöhen, in vivo nicht gezeigt.
Unsere In-vitro-Experimente am PCXI-Synchrotron zeigten, dass alle von uns getesteten Partikel mit Ausnahme des MP-Polystyrols in dem von uns verwendeten Bildgebungsaufbau sichtbar waren.In Gegenwart eines Magnetfelds bilden Magnetfelder Saiten, deren Länge von der Art der Teilchen und der Stärke des Magnetfelds (dh der Nähe und Bewegung des Magneten) abhängt.Wie in Abbildung 10 gezeigt, entstehen die beobachteten Saiten, wenn jedes einzelne Teilchen magnetisiert wird und sein eigenes lokales Magnetfeld induziert.Diese getrennten Felder bewirken, dass sich andere ähnliche Partikel ansammeln und sich aufgrund lokaler Kräfte von den lokalen Anziehungs- und Abstoßungskräften anderer Partikel mit Gruppen-String-Bewegungen verbinden.
Diagramm, das (a, b) Partikelketten zeigt, die sich in flüssigkeitsgefüllten Kapillaren bilden, und (c, d) eine luftgefüllte Luftröhre.Beachten Sie, dass die Kapillaren und die Luftröhre nicht maßstabsgetreu gezeichnet sind.Tafel (a) enthält auch eine Beschreibung der MF, die in Ketten angeordnete Fe3O4-Partikel enthält.
Als sich der Magnet über die Kapillare bewegte, erreichte der Winkel des Partikelstrangs die kritische Schwelle für Fe3O4 enthaltendes MP3-5, wonach der Partikelstrang nicht mehr in seiner ursprünglichen Position verblieb, sondern sich entlang der Oberfläche zu einer neuen Position bewegte.Magnet.Dieser Effekt tritt wahrscheinlich auf, weil die Oberfläche der Glaskapillare glatt genug ist, um diese Bewegung zuzulassen.Interessanterweise verhielt sich MP6 (CombiMag) nicht so, vielleicht weil die Partikel kleiner waren, eine andere Beschichtung oder Oberflächenladung hatten oder die proprietäre Trägerflüssigkeit ihre Bewegungsfähigkeit beeinträchtigte.Der Kontrast im CombiMag-Partikelbild ist ebenfalls schwächer, was darauf hindeutet, dass Flüssigkeit und Partikel die gleiche Dichte haben und sich daher nicht leicht aufeinander zubewegen können.Partikel können auch stecken bleiben, wenn sich der Magnet zu schnell bewegt, was darauf hinweist, dass die magnetische Feldstärke die Reibung zwischen Partikeln in der Flüssigkeit nicht immer überwinden kann, was darauf hindeutet, dass die magnetische Feldstärke und der Abstand zwischen dem Magneten und dem Zielbereich nicht gleich sein sollten Überraschung.wichtig.Diese Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass Magnete zwar viele Mikropartikel einfangen können, die durch den Zielbereich fließen, es aber unwahrscheinlich ist, dass sich Magnete darauf verlassen können, CombiMag-Partikel entlang der Oberfläche der Luftröhre zu bewegen.Daher kamen wir zu dem Schluss, dass In-vivo-LV-MF-Studien statische Magnetfelder verwenden sollten, um physisch auf bestimmte Bereiche des Atemwegsbaums abzuzielen.
Sobald die Partikel in den Körper gelangen, sind sie im Zusammenhang mit dem komplexen, sich bewegenden Gewebe des Körpers schwer zu identifizieren, aber ihre Erkennungsfähigkeit wurde verbessert, indem der Magnet horizontal über die Luftröhre bewegt wurde, um die MP-Fäden zu „wackeln“.Während Bildgebung in Echtzeit möglich ist, ist es einfacher, Partikelbewegungen zu erkennen, nachdem das Tier human getötet wurde.Die MP-Konzentrationen waren an dieser Stelle normalerweise am höchsten, wenn der Magnet über dem Abbildungsbereich positioniert war, obwohl einige Partikel normalerweise weiter unten in der Luftröhre gefunden wurden.Im Gegensatz zu In-vitro-Studien können Partikel nicht durch die Bewegung eines Magneten die Luftröhre hinuntergezogen werden.Dieser Befund stimmt damit überein, wie der Schleim, der die Oberfläche der Trachea bedeckt, typischerweise eingeatmete Partikel verarbeitet, sie im Schleim einfängt und sie anschließend durch den mukoziliaren Clearance-Mechanismus beseitigt.
Wir stellten die Hypothese auf, dass die Verwendung von Magneten über und unter der Luftröhre zur Anziehung (Abb. 3b) zu einem gleichmäßigeren Magnetfeld führen könnte, anstatt zu einem Magnetfeld, das an einem Punkt stark konzentriert ist, was möglicherweise zu einer gleichmäßigeren Verteilung der Partikel führt..Unsere vorläufige Studie fand jedoch keine eindeutigen Beweise für diese Hypothese.In ähnlicher Weise führte die Einstellung eines Magnetpaars zur Abstoßung (Abb. 3c) nicht dazu, dass sich mehr Partikel im Bildbereich absetzten.Diese beiden Ergebnisse zeigen, dass der Aufbau mit zwei Magneten die lokale Steuerung des MP-Zeigens nicht wesentlich verbessert und dass die resultierenden starken Magnetkräfte schwierig abzustimmen sind, was diesen Ansatz weniger praktisch macht.In ähnlicher Weise erhöhte auch die Ausrichtung des Magneten über und über der Luftröhre (Abbildung 3d) die Anzahl der im abgebildeten Bereich verbleibenden Partikel nicht.Einige dieser alternativen Konfigurationen sind möglicherweise nicht erfolgreich, da sie zu einer Verringerung der Magnetfeldstärke in der Abscheidungszone führen.Daher gilt die Einzelmagnetkonfiguration bei 30 Grad (Abb. 3a) als die einfachste und effizienteste In-vivo-Testmethode.
Die LV-MP-Studie zeigte, dass, wenn LV-Vektoren mit CombiMag kombiniert und nach körperlicher Störung in Gegenwart eines Magnetfelds abgegeben wurden, die Transduktionsniveaus in der Luftröhre im Vergleich zu Kontrollen signifikant anstiegen.Basierend auf Synchrotron-Bildgebungsstudien und LacZ-Ergebnissen schien das Magnetfeld in der Lage zu sein, das LV in der Luftröhre zu halten und die Anzahl der Vektorpartikel zu reduzieren, die sofort tief in die Lunge eindrangen.Solche Targeting-Verbesserungen können zu einer höheren Effizienz führen und gleichzeitig abgegebene Titer, nicht zielgerichtete Transduktion, entzündliche und immunologische Nebenwirkungen und Gentransferkosten reduzieren.Wichtig ist, dass CombiMag laut Hersteller in Kombination mit anderen Gentransfermethoden verwendet werden kann, einschließlich anderer viraler Vektoren (wie AAV) und Nukleinsäuren.