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Toxoplasma gondii ist ein intrazellulärer Protozoen-Parasit, der die Mikroumgebung des infizierten Wirts moduliert und bekanntermaßen mit dem Auftreten von Hirntumorwachstum assoziiert ist.In dieser Studie stellen wir die Hypothese auf, dass exosomale miRNA-21 aus einer Toxoplasma-Infektion das Wachstum von Hirntumoren fördert.Exosomen von mit Toxoplasma infizierten BV2-Mikroglia wurden charakterisiert und die Internalisierung von U87-Gliomzellen bestätigt.Exosomale microRNA-Expressionsprofile wurden unter Verwendung von Arrays von microRNA und microRNA-21A-5p analysiert, die mit Toxoplasma gondii und Tumorsortierung assoziiert sind.Wir untersuchten auch die mRNA-Spiegel tumorassoziierter Gene in U87-Gliomzellen, indem wir die miR-21-Spiegel in Exosomen und die Wirkung von Exosomen auf die Proliferation menschlicher U87-Gliomzellen veränderten.In Exosomen von mit Toxoplasma gondii infizierten U87-Gliomzellen ist die Expression von microRNA-21 erhöht und die Aktivität von Antitumor-Genen (FoxO1, PTEN und PDCD4) verringert.Von BV2 abgeleitete Exosomen, die mit Toxoplasma infiziert sind, induzieren die Proliferation von U87-Gliomzellen.Exosomen induzieren das Wachstum von U87-Zellen in einem Maus-Tumormodell.Wir schlagen vor, dass erhöhtes exosomales miR-21 in mit Toxoplasma infizierten BV2-Mikroglia eine wichtige Rolle als Zellwachstumsförderer in U87-Gliomzellen spielen kann, indem es Antitumor-Gene herunterreguliert.
Es wird geschätzt, dass im Jahr 2018 weltweit mehr als 18,1 Millionen Fälle von fortgeschrittenem Krebs diagnostiziert wurden, wobei jedes Jahr etwa 297.000 Tumore des zentralen Nervensystems diagnostiziert werden (1,6 % aller Tumoren)1.Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Risikofaktoren für die Entwicklung menschlicher Hirntumoren verschiedene chemische Produkte, Familienanamnese und ionisierende Strahlung von therapeutischen und diagnostischen Kopfgeräten umfassen.Die genaue Ursache dieser Malignome ist jedoch unbekannt.Etwa 20 % aller Krebserkrankungen weltweit werden durch Infektionserreger verursacht, darunter Viren, Bakterien und Parasiten3,4.Infektiöse Krankheitserreger stören die genetischen Mechanismen der Wirtszelle, wie die DNA-Reparatur und den Zellzyklus, und können zu chronischen Entzündungen und Schäden am Immunsystem führen5.
Infektionserreger, die mit menschlichem Krebs in Verbindung gebracht werden, sind die häufigsten viralen Pathogene, einschließlich humaner Papillomaviren und Hepatitis-B- und -C-Viren.Parasiten können auch eine potenzielle Rolle bei der Entstehung von Krebs beim Menschen spielen.Mehrere Parasitenarten, nämlich Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis und Hymenolepis nana, wurden mit verschiedenen Krebsarten beim Menschen in Verbindung gebracht 6,7,8.
Toxoplasma gondii ist ein intrazelluläres Protozoon, das die Mikroumgebung infizierter Wirtszellen reguliert.Es wird geschätzt, dass dieser Parasit ungefähr 30 % der Weltbevölkerung infiziert, wodurch die gesamte Bevölkerung gefährdet wird9,10.Toxoplasma gondii kann lebenswichtige Organe, einschließlich des Zentralnervensystems (ZNS), infizieren und schwere Erkrankungen wie tödliche Meningitis und Enzephalitis verursachen, insbesondere bei immungeschwächten Patienten9.Toxoplasma gondii kann jedoch auch die Umgebung des infizierten Wirts verändern, indem es das Zellwachstum und die Immunantworten bei immunkompetenten Personen moduliert, was zur Aufrechterhaltung einer asymptomatischen chronischen Infektion führt9,11.Angesichts der Korrelation zwischen T. gondii-Prävalenz und Hirntumorinzidenz deuten einige Berichte interessanterweise darauf hin, dass in vivo-Wirtsumgebungsveränderungen aufgrund einer chronischen T. gondii-Infektion der Mikroumgebung des Tumors ähneln.
Exosomen sind als interzelluläre Kommunikatoren bekannt, die biologische Inhalte, einschließlich Proteine ​​und Nukleinsäuren, von benachbarten Zellen liefern16,17.Exosomen können tumorbezogene biologische Prozesse wie Anti-Apoptose, Angiogenese und Metastasierung in der Mikroumgebung des Tumors beeinflussen.Insbesondere miRNAs (miRNAs), kleine nichtkodierende RNAs mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden, sind wichtige posttranskriptionelle Genregulatoren, die mehr als 30 % der menschlichen mRNA durch den miRNA-induzierten Silencing-Komplex (miRISC) kontrollieren.Toxoplasma gondii kann biologische Prozesse stören, indem es die miRNA-Expression in infizierten Wirten kontrolliert.Wirts-miRNAs enthalten wichtige Signale zur Regulierung biologischer Prozesse des Wirts, um die Überlebensstrategie des Parasiten zu erreichen.Daher kann die Untersuchung von Änderungen im miRNA-Profil des Wirts nach einer Infektion mit T. gondii uns helfen, die Interaktion zwischen dem Wirt und T. gondii klarer zu verstehen.Tatsächlich haben Thirugnanam et al.15 legten nahe, dass T. gondii die Gehirnkarzinogenese fördert, indem es seine Expression auf spezifischen miRNAs des Wirts verändert, die mit Tumorwachstum assoziiert sind, und fanden heraus, dass T. gondii bei Versuchstieren Gliome verursachen kann.
Diese Studie konzentriert sich auf die Veränderung von exosomalem miR-21 in mit Toxoplasma BV2 infizierten Wirtsmikroglia.Wir beobachteten eine mögliche Rolle von verändertem exosomalem miR-21 beim Wachstum von U87-Gliomzellen aufgrund der Retention von FoxO1/p27 im Zellkern, das das Ziel von überexprimiertem miR-21 ist.
Von BV2 abgeleitete Exosomen wurden unter Verwendung von differentieller Zentrifugation erhalten und durch verschiedene Methoden validiert, um eine Kontamination mit zellulären Komponenten oder anderen Vesikeln zu verhindern.SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zeigte unterschiedliche Muster zwischen Proteinen, die aus BV2-Zellen und Exosomen extrahiert wurden (Abbildung 1A), und Proben wurden auf das Vorhandensein von Alix untersucht, das durch Western-Blotting von exosomalen Proteinmarkern in analysiert wurde.Die Alix-Markierung wurde in Exosomenproteinen gefunden, aber nicht in BV2-Zelllysatproteinen ( 1B ).Außerdem wurde gereinigte RNA aus Exosomen, die von BV2 stammten, mit einem Bioanalysegerät analysiert.Ribosomale 18S- und 28S-Untereinheiten wurden im exosomalen RNA-Migrationsmuster selten beobachtet, was auf eine zuverlässige Reinheit hindeutet (Abbildung 1C).Schließlich zeigte die Transmissionselektronenmikroskopie, dass die beobachteten Exosomen etwa 60–150 nm groß waren und eine für die Exosomenmorphologie typische becherartige Struktur aufwiesen (Abb. 1D).
Charakterisierung von Exosomen, die von BV2-Zellen stammen.(A) Seite Sicherheitsdatenblatt.Proteine ​​wurden aus BV2-Zellen oder von BV2 abgeleiteten Exosomen isoliert.Proteinmuster unterscheiden sich zwischen Zellen und Exosomen.(B) Western-Blot-Analyse eines exosomalen Markers (Alix).(C) Bewertung von gereinigter RNA aus BV2-Zellen und BV2-abgeleiteten Exosomen unter Verwendung eines Bioanalyzers.Daher wurden ribosomale 18S- und 28S-Untereinheiten in BV2-Zellen selten in exosomaler RNA gefunden.(D) Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass aus BV2-Zellen isolierte Exosomen mit 2 % Uranylacetat negativ gefärbt waren.Exosomen sind etwa 60–150 nm groß und becherförmig (Song und Jung, unveröffentlichte Daten).
Die zelluläre Internalisierung von BV2-abgeleiteten Exosomen in menschliche U87-Gliomzellen wurde unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie beobachtet.PKH26-markierte Exosomen sind im Zytoplasma von U87-Zellen lokalisiert.Kerne wurden mit DAPI gefärbt (Abb. 2A), was darauf hinweist, dass von BV2 stammende Exosomen von Wirtszellen internalisiert werden und die Umgebung von Empfängerzellen beeinflussen können.
Die Internalisierung von BV2-abgeleiteten Exosomen in U87-Gliomzellen und von BV2-abgeleiteten Exosomen, die mit Toxoplasma RH infiziert waren, induzierte die Proliferation von U87-Gliomzellen.(A) Von U87-Zellen verschlungene Exosomen, gemessen durch konfokale Mikroskopie.U87-Gliomzellen wurden mit Exosomen, die mit PKH26 (rot) oder ohne Kontrolle markiert waren, 24 Stunden lang inkubiert.Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt und dann unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet (Maßstab: 10 μm, x 3000).(B) Die Proliferation von U87-Gliomzellen wurde durch einen Zellproliferationsassay bestimmt.U87-Gliomzellen wurden für die angegebene Zeit mit Exosomen behandelt. *P < 0,05 wurde durch Student's t-Test erhalten. *P < 0,05 wurde durch Student's t-Test erhalten. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 gemäß Student's t-Test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, erhalten unter Verwendung des Student-t-Tests.
Nachdem wir die Internalisierung von BV2-abgeleiteten Exosomen in U87-Gliomzellen bestätigt hatten, führten wir Zellproliferationsassays durch, um die Rolle von BV2-abgeleiteten Toxoplasma-abgeleiteten Exosomen bei der Entwicklung menschlicher Gliomzellen zu untersuchen.Die Behandlung von U87-Zellen mit Exosomen von mit T. gondii infizierten BV2-Zellen zeigte, dass mit T. gondii infizierte, von BV2 abgeleitete Exosomen eine signifikant höhere Proliferation von U87-Zellen im Vergleich zur Kontrolle verursachten ( 2B ).
Außerdem hatte das Wachstum von U118-Zellen die gleichen Ergebnisse wie U87, da durch Toxoplasma stimulierte Exosomen die höchsten Proliferationsniveaus verursachten (Daten nicht gezeigt).Basierend auf diesen Daten können wir darauf hinweisen, dass BV2-abgeleitete Toxoplasma-infizierte Exosomen eine wichtige Rolle bei der Proliferation von Gliomzellen spielen.
Um die Wirkung von Toxoplasma-infizierten BV2-abgeleiteten Exosomen auf die Tumorentwicklung zu untersuchen, injizierten wir U87-Gliomzellen in Nacktmäuse für ein Xenograft-Modell und injizierten BV2-abgeleitete Exosomen oder RH-infizierte BV2-abgeleitete Exosomen.Nachdem Tumore nach 1 Woche sichtbar wurden, wurde jede experimentelle Gruppe von 5 Mäusen gemäß der Tumorgröße aufgeteilt, um den gleichen Ausgangspunkt zu bestimmen, und die Tumorgröße wurde 22 Tage lang gemessen.
Bei Mäusen mit dem U87-Xenotransplantatmodell wurden am Tag 22 in der BV2-abgeleiteten RH-infizierten Exosomengruppe eine signifikant größere Tumorgröße und ein signifikant größeres Gewicht beobachtet ( 3A , B).Andererseits gab es keinen signifikanten Unterschied in der Tumorgröße zwischen der BV2-abgeleiteten Exosomengruppe und der Kontrollgruppe nach Exosomenbehandlung.Außerdem zeigten Mäuse, denen Gliomzellen und Exosomen injiziert worden waren, visuell das größte Tumorvolumen in der Gruppe der RH-infizierten, von BV2 stammenden Exosomen ( 3C ).Diese Ergebnisse zeigen, dass BV2-abgeleitete Toxoplasma-infizierte Exosomen Gliomwachstum in einem Maus-Tumormodell induzieren.
Onkogenese (AC) von BV2-abgeleiteten Exosomen in einem U87-Xenograft-Mausmodell.Die Tumorgröße (A) und das Gewicht (B) waren bei BALB/c-Nacktmäusen, die mit RH-infizierten Exosomen, die von BV2 stammen, behandelt wurden, signifikant erhöht.BALB/c-Nacktmäusen (C) wurden subkutan 1 × 10 7 U87-Zellen, suspendiert in einer Matrigel-Mischung, injiziert.Sechs Tage nach der Injektion wurden 100 &mgr;g BV2-abgeleitete Exosomen in Mäusen behandelt.Tumorgröße und -gewicht wurden an den angegebenen Tagen bzw. nach der Tötung gemessen. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05。 *P < 0,05。 *Р < 0,05. *P < 0,05.
Die Daten zeigten, dass 37 miRNAs (16 überexprimiert und 21 herunterexprimiert), die mit Immunität oder Tumorentwicklung assoziiert sind, in Mikroglia nach Infektion mit dem Toxoplasma-RH-Stamm signifikant verändert waren (Abb. 4A).Die relativen Expressionsniveaus von miR-21 unter veränderten miRNAs wurden durch Echtzeit-RT-PCR in Exosomen bestätigt, die von BV2 stammen, Exosomen, die mit BV2- und U87-Zellen behandelt wurden.Die Expression von miR-21 zeigte eine signifikante Zunahme der Exosomen von BV2-Zellen, die mit Toxoplasma gondii (RH-Stamm) infiziert waren (Fig. 4B).Die relativen Expressionsniveaus von miR-21 in BV2- und U87-Zellen stiegen nach der Aufnahme von veränderten Exosomen (Fig. 4B).Die relativen Niveaus der miR-21-Expression in den Gehirngeweben von Tumorpatienten und Mäusen, die mit Toxoplasma gondii (ME49-Stamm) infiziert waren, waren jeweils höher als bei Kontrollen (Abb. 4C).Diese Ergebnisse korrelieren mit Unterschieden zwischen den Expressionsniveaus vorhergesagter und bestätigter microRNAs in vitro und in vivo.
Veränderungen in der Expression von exosomalem miP-21a-5p in mit Toxoplasma gondii (RH) infizierten Mikroglia.(A) Zeigt signifikante Veränderungen in der siRNA, die mit der Immunität oder der Tumorentwicklung nach einer T. gondii RH-Infektion assoziiert sind.(B) Relative miR-21-Expressionsniveaus wurden durch Echtzeit-RT-PCR in BV2-abgeleiteten Exosomen, BV2-behandelten Exosomen und U87-Zellen nachgewiesen.(C) Relative miR-21-Expressionsniveaus wurden in den Gehirngeweben von Tumorpatienten (N = 3) und mit Toxoplasma gondii (ME49-Stamm) (N = 3) infizierten Mäusen gefunden. *P < 0,05 wurde durch Student's t-Test erhalten. *P < 0,05 wurde durch Student's t-Test erhalten. *P < 0,05 *P < 0,05 wurde unter Verwendung des Student-t-Tests erhalten. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, erhalten unter Verwendung des Student-t-Tests.
Exosomen von RH-infizierten BV2-Zellen führten in vivo und in vitro zum Wachstum von Gliomen (Abb. 2, 3).Um relevante mRNAs nachzuweisen, untersuchten wir die mRNA-Spiegel von Antitumor-Zielgenen, Forkhead Box O1 (FoxO1), PTEN und programmiertem Zelltod 4 (PDCD4) in U87-Zellen, die mit Exosomen infiziert waren, die von BV2 oder RH BV2 stammen.Bioinformatische Analysen haben gezeigt, dass mehrere tumorassoziierte Gene, darunter die Gene FoxO1, PTEN und PDCD4, miR-2121,22-Bindungsstellen aufweisen.Die mRNA-Spiegel von Antitumor-Zielgenen waren in RH-infizierten, von BV2 stammenden Exosomen im Vergleich zu von BV2 stammenden Exosomen reduziert ( 5A ).FoxO1 zeigte reduzierte Proteinspiegel in RH-infizierten BV2-abgeleiteten Exosomen im Vergleich zu BV2-abgeleiteten Exosomen (Abbildung 5B).Basierend auf diesen Ergebnissen konnten wir bestätigen, dass Exosomen, die von RH-infiziertem BV2 stammen, anti-onkogene Gene herunterregulieren und ihre Rolle beim Tumorwachstum beibehalten.
Toxoplasma RH-infizierte BV2-abgeleitete Exosomen induzieren die Unterdrückung von Antitumor-Genen in U87-Gliomzellen durch Toxoplasma RH-infizierte BV2-abgeleitete Exosomen.(A) Echtzeit-PCR der FoxO1-, PTEN- und PDCD4-Expression in Exosomen, die von T. gondii RH-infiziertem BV2 stammen, im Vergleich zu PBS-Exosomen.Als Kontrolle wurde β-Aktin-mRNA verwendet.(B) Die FoxO1-Expression wurde durch Western-Blotting bestimmt und die Densitometriedaten wurden mit dem ImageJ-Programm statistisch ausgewertet. *P < 0,05 wurde durch Student's t-Test erhalten. *P < 0,05 wurde durch Student's t-Test erhalten. *P < 0,05 *P < 0,05 wurde unter Verwendung des Student-t-Tests erhalten. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05, erhalten unter Verwendung des Student-t-Tests.
Um die Wirkung von miP-21 in Exosomen auf die tumorassoziierte Genregulation zu verstehen, wurden U87-Zellen mit einem Inhibitor von miP-21 unter Verwendung von Lipofectamine 2000 transfiziert und die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion geerntet.Die FoxO1- und p27-Expressionsniveaus in mit miR-21-Inhibitoren transfizierten Zellen wurden mit Zellen verglichen, die mit BV2-abgeleiteten Exosomen unter Verwendung von qRT-PCR behandelt wurden (Abb. 6A, B).Die Transfektion des miR-21-Inhibitors in U87-Zellen regulierte die FoxO1- und p27-Expression signifikant herunter ( 6 ).
RH-infiziertes exosomales BV2-abgeleitetes miP-21 veränderte die FoxO1/p27-Expression in U87-Gliomzellen.U87-Zellen wurden mit miP-21-Inhibitor unter Verwendung von Lipofectamine 2000 transfiziert und die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion geerntet.Die FoxO1- und p27-Expressionsniveaus in Zellen, die mit miR-21-Inhibitoren transfiziert wurden, wurden mit den Niveaus in Zellen verglichen, die mit BV2-abgeleiteten Exosomen unter Verwendung von qRT-PCR behandelt wurden (A, B).
Um der Immunantwort des Wirts zu entgehen, verwandelt sich der Parasit Toxoplasma in eine Gewebezyste.Sie parasitieren während der gesamten Lebenszeit des Wirts verschiedene Gewebe, einschließlich des Gehirns, des Herzens und der Skelettmuskulatur, und modulieren die Immunantwort des Wirts.Darüber hinaus können sie den Zellzyklus und die Apoptose von Wirtszellen regulieren und deren Proliferation fördern14,24.Toxoplasma gondii infiziert überwiegend dendritische Wirtszellen, Neutrophile und Monozyten/Makrophagen-Linien, einschließlich Mikroglia im Gehirn.Toxoplasma gondii induziert die Differenzierung von Makrophagen des M2-Phänotyps, beeinflusst die Wundheilung nach einer Pathogeninfektion und ist auch mit Hypervaskularisation und granulomatöser Fibrose assoziiert.Diese Verhaltenspathogenese der Toxoplasma-Infektion kann mit Markern zusammenhängen, die mit der Tumorentwicklung assoziiert sind.Die durch Toxoplasma regulierte feindliche Umgebung kann der entsprechenden Krebsvorstufe ähneln.Daher ist davon auszugehen, dass eine Toxoplasma-Infektion zur Entstehung von Hirntumoren beitragen sollte.Tatsächlich wurden hohe Raten von Toxoplasma-Infektionen im Serum von Patienten mit verschiedenen Gehirntumoren berichtet.Darüber hinaus kann Toxoplasma gondii ein weiterer karzinogener Effektor sein und synergistisch wirken, um anderen infektiösen Karzinogenen bei der Entwicklung von Hirntumoren zu helfen.In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass P. falciparum und das Epstein-Barr-Virus synergistisch zur Bildung des Burkitt-Lymphoms beitragen.
Die Rolle von Exosomen als Regulatoren im Bereich der Krebsforschung wurde umfassend untersucht.Die Rolle von Exosomen zwischen Parasiten und infizierten Wirten bleibt jedoch weitgehend unverstanden.Bisher haben verschiedene Regulatoren, einschließlich sekretierter Proteine, die biologischen Prozesse erklärt, durch die protozoische Parasiten Wirtsangriffen widerstehen und die Infektion aufrechterhalten.Vor kurzem gab es ein wachsendes Konzept, dass Protozoen-assoziierte Mikrovesikel und ihre microRNAs mit Wirtszellen interagieren, um eine günstige Umgebung für ihr Überleben zu schaffen.Daher sind weitere Studien erforderlich, um die Beziehung zwischen veränderten exosomalen miRNAs und der Proliferation von Gliomzellen zu entdecken.MikroRNA-Veränderung (Cluster-Gene miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 und miR-17-92) bindet an den STAT3-Promotor in Toxoplasma-infizierten menschlichen Makrophagen, wird reguliert und induziert Anti -Apoptose als Reaktion auf eine Infektion mit Toxoplasma gondii 29 .Eine Toxoplasma-Infektion erhöht die Expression von miR-17-5p und miR-106b-5p, die mit mehreren hyperproliferativen Erkrankungen assoziiert sind 30 .Diese Daten deuten darauf hin, dass Wirts-miRNAs, die durch eine Toxoplasma-Infektion reguliert werden, wichtige Moleküle für das Überleben von Parasiten und die Pathogenese im biologischen Verhalten des Wirts sind.
Veränderte miRNAs können verschiedene Arten von Verhalten während der Initiierung und Progression von malignen Zellen, einschließlich Gliomen, beeinflussen: Selbstversorgung mit Wachstumssignalen, Unempfindlichkeit gegenüber wachstumshemmenden Signalen, Apoptose-Umgehung, unbegrenztes Replikationspotential, Angiogenese, Invasion und Metastasierung und Entzündung.Bei Gliomen wurden in mehreren Studien zur Expressionsprofilierung veränderte miRNAs identifiziert.
In der vorliegenden Studie bestätigten wir ein hohes Maß an miRNA-21-Expression in Toxoplasma-infizierten Wirtszellen.miR-21 wurde als eine der am häufigsten überexprimierten microRNAs in soliden Tumoren, einschließlich Gliomen, identifiziert 33 und ihre Expression korreliert mit dem Gliomgrad.Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass miR-21 ein neuartiges Onkogen ist, das als antiapoptotischer Faktor beim Wachstum von Gliomen wirkt und in Geweben und Plasma bösartiger Erkrankungen des menschlichen Gehirns stark überexprimiert wird.Interessanterweise löst die Inaktivierung von miR-21 in Gliomzellen und -geweben die Hemmung der Zellproliferation aufgrund von Caspase-abhängiger Apoptose aus.Die bioinformatische Analyse der von miR-21 vorhergesagten Ziele ergab mehrere Tumorsuppressorgene, die mit Apoptosewegen assoziiert sind, darunter der programmierte Zelltod 4 (PDCD4), Tropomyosin (TPM1), PTEN und Forkhead Box O1 (FoxO1) mit der miR-2121-Bindungsstelle..22.38.
FoxO1 ist als einer der Transkriptionsfaktoren (FoxO) an der Entstehung verschiedener Krebsarten beim Menschen beteiligt und kann die Expression von Tumorsuppressorgenen wie p21, p27, Bim und FasL40 regulieren.FoxO1 kann Zellzyklus-Inhibitoren wie p27 binden und aktivieren, um das Zellwachstum zu unterdrücken.Darüber hinaus ist FoxO1 ein Schlüsseleffektor der PI3K/Akt-Signalgebung und reguliert viele biologische Prozesse wie Zellzyklusprogression und Zelldifferenzierung durch Aktivierung der p2742-Transkription.
Zusammenfassend glauben wir, dass exosomales miR-21, das aus Toxoplasma-infizierter Mikroglia stammt, eine wichtige Rolle als Wachstumsregulator von Gliomzellen spielen kann (Abb. 7).Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um einen direkten Zusammenhang zwischen exosomalem miR-21, veränderter Toxoplasma-Infektion und Gliomwachstum zu finden.Diese Ergebnisse sollen einen Ausgangspunkt für die Untersuchung der Beziehung zwischen einer Toxoplasma-Infektion und dem Auftreten von Gliomen bieten.
In dieser Studie wird ein schematisches Diagramm des Mechanismus der Karzinogenese von Gliomen (Gehirn) vorgeschlagen.Der Autor zeichnet in PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alle experimentellen Protokolle in dieser Studie, einschließlich der Verwendung von Tieren, standen im Einklang mit den ethischen Standardrichtlinien der Seoul National University Animal Care and User Committee und wurden vom Institutional Review Board der Seoul National University School of Medicine (IRB-Nummer SNU- 150715).-2).Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den ARRIVE-Empfehlungen durchgeführt.
BV2-Maus-Mikroglia und menschliche U87-Gliomzellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) bzw. Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene) kultiviert, die jeweils 10 % fötales Rinderserum, 4 mM l- Glutamin, 0,2 mM Penicillin und 0,05 mM Streptomycin.Die Zellen wurden in einem Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 °C kultiviert.Eine andere Gliomzelllinie, U118, wurde zum Vergleich mit U87-Zellen verwendet.
Um Exosomen von mit T. gondii infizierten RH- und ME49-Stämmen zu isolieren, wurden T. gondii-Tachyzoiten (RH-Stamm) aus der Bauchhöhle von 6 Wochen alten BALB/c-Mäusen geerntet, denen 3–4 Tage zuvor eine Injektion verabreicht worden war.Tachyzoiten wurden dreimal mit PBS gewaschen und durch Zentrifugation in 40 % Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gereinigt43.Um Tachyzoiten des Stamms ME49 zu erhalten, wurden BALB/c-Mäusen intraperitoneal 20 Gewebezysten injiziert, und die Tachyzoiten-Transformation in Zysten wurde durch Waschen der Bauchhöhle am 6.–8. Tag nach der Infektion (PI) gesammelt.Mit PBS infizierte Mäuse.ME49-Tachyzoiten wurden in Zellen gezüchtet, die mit 100 μg/ml Penicillin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml Streptomycin (Gibco/BRL) und 5 % fötalem Rinderserum (Lonza, Walkersville, MD) ergänzt waren. .., USA) bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Nach der Kultivierung in Vero-Zellen wurden ME49-Tachyzoiten zweimal durch eine 25-Gauge-Nadel und dann durch einen 5-μm-Filter geleitet, um Trümmer und Zellen zu entfernen.Nach dem Waschen wurden die Tachyzoiten in PBS44 resuspendiert.Gewebezysten von Toxoplasma gondii-Stamm ME49 wurden durch intraperitoneale Injektion von Zysten, die aus dem Gehirn infizierter C57BL/6-Mäuse isoliert wurden (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea), erhalten.Die Gehirne von ME49-infizierten Mäusen wurden nach 3 Monaten PI geerntet und unter einem Mikroskop zerkleinert, um Zysten zu isolieren.Die infizierten Mäuse wurden an der Seoul National University School of Medicine unter speziellen pathogenfreien Bedingungen (SPF) gehalten.
Gesamt-RNA wurde aus BV2-abgeleiteten Exosomen, BV2-Zellen und Geweben unter Verwendung des miRNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert, einschließlich der Inkubationszeit für den Elutionsschritt.Die RNA-Konzentration wurde auf einem Spektrophotometer NanoDrop 2000 bestimmt.Die Qualität der RNA-Microarrays wurde mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, Niederlande) bewertet.
DMEM mit 10 % Exosomen-armem FBS wurde durch Ultrazentrifugation bei 100.000 g für 16 Stunden bei 4°C hergestellt und durch einen 0,22-μm-Filter (Nalgene, Rochester, NY, USA) filtriert.BV2-Zellen, 5 × 105, wurden in DMEM kultiviert, das 10 % Exosomen-depletiertes FBS und 1 % Antibiotika bei 37 °C und 5 % CO2 enthielt.Nach 24 Stunden Inkubation wurden Tachyzoiten des Stamms RH oder ME49 (MOI = 10) zu den Zellen gegeben und nicht eindringende Parasiten wurden innerhalb einer Stunde entfernt und mit DMEM wieder aufgefüllt.Exosomen aus BV2-Zellen wurden durch modifizierte differentielle Zentrifugation, die am weitesten verbreitete Methode, isoliert.Resuspendieren Sie das Exosom-Pellet in 300 ul PBS für die RNA- oder Proteinanalyse.Die Konzentration isolierter Exosomen wurde unter Verwendung eines BCA-Protein-Assay-Kits (Pierce, Rockford, IL, USA) und eines NanoDrop 2000-Spektrophotometers bestimmt.
Präzipitate von BV2-Zellen oder von BV2 abgeleitete Exosomen wurden in PRO-PREP™-Proteinextraktionslösung (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) lysiert und Proteine ​​wurden auf mit Coomassie-Brillantblau gefärbte 10 % SDS-Polyacrylamidgele geladen.Zusätzlich wurden Proteine ​​für 2 Stunden auf PVDF-Membranen übertragen.Western Blots wurden unter Verwendung des Alix-Antikörpers (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) als exosomaler Marker validiert.Als Sekundärantikörper wurden HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) und ein LAS-1000 plus Lumineszenzbildanalysator (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) verwendet..Transmissionselektronenmikroskopie wurde durchgeführt, um die Größe und Morphologie von Exosomen zu untersuchen.Aus BV2-Zellen isolierte Exosomen (6,40 µg/µl) wurden auf kohlenstoffbeschichteten Netzen präpariert und mit 2 % Uranylacetat für 1 Minute negativ gefärbt.Die vorbereiteten Proben wurden bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV unter Verwendung eines JEOL 1200-EX II (Tokio, Japan), ausgestattet mit einer ES1000W Erlangshen CCD-Kamera (Gatan, Pleasanton, CA, USA), beobachtet.
Von BV2 abgeleitete Exosomen wurden mit dem PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt.U87-Zellen, 2 × 105, mit PKH26-markierten Exosomen (rot) oder ohne Exosomen als Negativkontrolle, wurden bei 37 °C für 24 Stunden in einem Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert.U87-Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt, U87-Zellen wurden in 4% Paraformaldehyd für 15 min bei 4°C fixiert und dann in einem konfokalen Mikroskopsystem Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Deutschland) analysiert.beobachtbar.
cDNA wurde aus siRNA unter Verwendung von Mir-X-siRNA-Erststrangsynthese und SYBR-qRT-PCR-Kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) synthetisiert.Quantitative Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung des iQ5-Echtzeit-PCR-Nachweissystems (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) unter Verwendung von Primern und Matrizen, gemischt mit SYBR-Vormischung, durchgeführt.DNA wurde für 40 Denaturierungszyklen bei 95°C für 15 s und Annealing bei 60°C für 60 s amplifiziert.Die Daten von jeder PCR-Reaktion wurden unter Verwendung des Datenanalysemoduls der optischen Systemsoftware iQ™5 (Bio-Rad) analysiert.Relative Änderungen in der Genexpression zwischen ausgewählten Zielgenen und β-Aktin/siRNA (und U6) wurden unter Verwendung der Standardkurvenmethode berechnet.Die verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1 gezeigt.
3 x 104 U87-Gliomzellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und nach 12, 18 und 36 Stunden mit Toxoplasma-infizierten Exosomen, die von BV2 stammen (50 μg/ml) oder nicht gepulsten Exosomen, die von BV2 stammen (50 μg/ml), als Kontrollen gemischt .Die Zellproliferationsrate wurde mit dem Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (ergänzende Abbildungen S1-S3) 46 bestimmt.
5 Wochen alte weibliche BALB/c-Nacktmäuse wurden von Orient Bio (Seongnam-si, Südkorea) erworben und einzeln in sterilen Käfigen bei Raumtemperatur (22 ± 2 °C) und Feuchtigkeit (45 ± 15 °C) gehalten.%) bei Raumtemperatur (22±2°C) und Luftfeuchtigkeit (45±15%).Ein 12-Stunden-Lichtzyklus und ein 12-Stunden-Dunkelzyklus wurden unter SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center) durchgeführt.Die Mäuse wurden zufällig in drei Gruppen von jeweils 5 Mäusen eingeteilt, und allen Gruppen wurden subkutan 400 ml PBS injiziert, das 1 × 10 7 U87-Gliomzellen und wachstumsfaktorreduziertes BD Matrigel TM (BD Science, Miami, FL, USA) enthielt.Sechs Tage nach der Tumorinjektion wurden 200 mg Exosomen, die von BV2-Zellen (mit/ohne Toxoplasma-Infektion) stammten, in die Tumorstelle injiziert.Zweiundzwanzig Tage nach der Tumorinfektion wurde die Tumorgröße der Mäuse in jeder Gruppe dreimal pro Woche mit einer Schieblehre gemessen, und das Tumorvolumen wurde nach folgender Formel berechnet: 0,5 × (Breite) × 2 × Länge.
MicroRNA-Expressionsanalyse mit miRCURYTM LNA miRNA-Array, 7. Generation, mmu- und rno-Arrays (EXIQON, Vedbaek, Dänemark), die 1119 gut charakterisierte Mäuse unter 3100 menschlichen, Maus- und Ratten-miRNA-Capture-Sonden abdecken.Während dieses Verfahrens wurden 250 bis 1000 ng Gesamt-RNA aus dem 5'-Phosphat durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm entfernt, gefolgt von Markierung mit grünem Hy3-Fluoreszenzfarbstoff.Die markierten Proben wurden dann hybridisiert, indem Mikroarray-Objektträger unter Verwendung eines Hybridisierungskammer-Kits (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) und eines Hybridisierungs-Objektträger-Kits (Agilent Technologies) geladen wurden.Die Hybridisierung wurde für 16 Stunden bei 56°C durchgeführt, dann wurden die Microarrays gemäß den Empfehlungen des Herstellers gewaschen.Die verarbeiteten Microarray-Objektträger wurden dann unter Verwendung eines Agilent G2565CA Microarray-Scannersystems (Agilent Technologies) gescannt.Gescannte Bilder wurden mit der Agilent Feature Extraction Software Version 10.7.3.1 (Agilent Technologies) importiert und die Fluoreszenzintensität jedes Bildes wurde mit der entsprechenden GAL-Datei des modifizierten Exiqon-Protokolls quantifiziert.Microarray-Daten für die aktuelle Studie sind in der GEO-Datenbank unter der Zugangsnummer GPL32397 hinterlegt.
Expressionsprofile von reifen exosomalen miRNAs in Mikroglia von mit Toxoplasma infizierten RH- oder ME49-Stämmen wurden mit verschiedenen Netzwerk-Tools analysiert.Mit der Tumorentwicklung assoziierte miRNAs wurden mit miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) identifiziert und mit einer normalisierten Signalintensität (log2) größer als 8,0 herausgefiltert.Unter den miRNAs wurde durch Filteranalyse von miRNAs, die durch mit T. gondii infizierte RH- oder ME49-Stämme verändert wurden, festgestellt, dass differentiell exprimierte miRNAs mehr als 1,5-fach verändert waren.
Die Zellen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen (3 × 10 5 Zellen/Vertiefung) in opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ausgesät.Die transfizierten Zellen wurden für 6 Stunden kultiviert und dann wurde das Medium gegen frisches Vollmedium ausgetauscht.Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion geerntet.
Die statistische Analyse wurde hauptsächlich unter Verwendung des Student's t-Tests mit der Excel-Software (Microsoft, Washington, DC, USA) durchgeführt.Für die experimentelle Tieranalyse wurde eine Zweiweg-ANOVA unter Verwendung der Prism 3.0-Software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. P 值< 0,05 P < 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Alle in dieser Studie verwendeten experimentellen Protokolle wurden vom Institutional Review Board der Seoul National University School of Medicine (IRB-Nummer SNU-150715-2) genehmigt.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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