Giardia duodenum ist ein parasitärer Organismus, der Giardiasis verursacht, eine Darminfektion, die besonders häufig bei kleinen Kindern mit klinischen Anzeichen von Durchfall auftritt.Wir haben zuvor berichtet, dass extrazellulärer G. duodenalis die Aktivierung intrazellulärer Oligomerisierungs-ähnlicher Rezeptor 3 (NLRP3)-bindender Nukleotide auslöst und Entzündungsreaktionen des Wirts durch die Sekretion extrazellulärer Vesikel (EV) reguliert.Die genauen molekularen Muster des pathogenassoziierten Duodenokokken-EV (GEV), das an diesem Prozess beteiligt ist, und die Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei Giardiasis müssen jedoch noch geklärt werden.
Rekombinante eukaryotische Expressionsplasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 und alpha-7.3 Giardine in GEV wurden konstruiert, in primäre Peritonealmakrophagen der Maus transfiziert und durch Messung des Entzündungszielmoleküls Caspase-1 nachgewiesen.Das p20-Expressionsniveau wurde gescreent..G. duodenalis alpha-2 und alpha-7.3 Giardines wurden ursprünglich durch Messung der NLRP3-Inflammasom- (NLRP3, Pro-Interleukin-1 Beta [IL-1β], Pro-Caspase-1 und Caspase-1 p20) und IL-Sekretion identifiziert.1β-Spiegel, Apoptotic Spotted Protein (ASC)-Oligomerisierungsgrade und immunfluoreszierende Lokalisierung von NLRP3 und ASC.Anschließend wurde die Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei der Pathogenität von G. duodenalis anhand von Mäusen untersucht, bei denen die NLRP3-Aktivierung blockiert war (NLRP3-blockierte Mäuse), und pathologische Veränderungen des Körpergewichts, der Zwölffingerdarmparasitenlast und des Zwölffingerdarmgewebes wurden überwacht.Darüber hinaus untersuchten wir, ob die Hiardine alpha-2 und alpha-7.3 in vivo über das NLRP3-Inflammasom die IL-1β-Sekretion induzieren, und bestimmten die Rolle dieser Moleküle bei der Pathogenität von G. duodenalis bei Mäusen.
Alpha-2- und Alpha-7.3-Giardine induzieren in vitro die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms.Dies führte zur Aktivierung von p20-Caspase-1, einem Anstieg der Expressionsniveaus von NLRP3, Pro-IL-1β und Pro-Caspase-1-Proteinen, einem signifikanten Anstieg der IL-1β-Sekretion und der Bildung von ASA-Spots im Zytoplasma und die Induktion der ASA-Oligomerisierung.NLRP3-Entzündung Penisverlust verstärkt die Pathogenität von G. duodenalis bei Mäusen.Mäuse, die durch Sondenernährung von NLRP3-blockierten Mäusen mit Zysten behandelt wurden, zeigten eine erhöhte Anzahl von Trophozoiten und schwere Schäden an den Zwölffingerdarmzotten, gekennzeichnet durch nekrotische Krypten mit Schrumpfung und Verzweigung.In-vivo-Experimente haben gezeigt, dass die Giardine alpha-2 und alpha-7.3 die Sekretion von IL-1β über das NLRP3-Inflammasom induzieren können, und die Immunisierung mit den Giardinen alpha-2 und alpha-7.3 verringerte die Pathogenität von G. duodenalis bei Mäusen.
Zusammengenommen legen die Ergebnisse dieser Studie nahe, dass Giardia alpha-2 und alpha-7.3 eine Hochregulierung der NLRP3-Entzündung des Wirts bewirken und die Infektiosität von G. duodenalis bei Mäusen verringern, was vielversprechende Ziele zur Vorbeugung von Giardiasis sind.
Giardia duodenum ist ein extrazellulärer Protozoenparasit, der im Dünndarm lebt und jährlich 280 Millionen Fälle von Giardiasis mit Durchfall verursacht, insbesondere bei kleinen Kindern in Entwicklungsländern [1].Menschen infizieren sich durch Trinkwasser oder Nahrungsmittel, die mit M. duodenum-Zysten kontaminiert sind, die dann in den Magen gelangen und über den Magensaft ausgeschieden werden.Giardia duodenum-Trophozoiten heften sich an das Zwölffingerdarmepithel und verursachen Übelkeit, Erbrechen, Durchfall, Bauchschmerzen und Gewichtsverlust.Personen mit Immunschwäche und Mukoviszidose sind anfällig für Infektionen.Eine Infektion kann auch durch Oral- und Analsex erfolgen [2].Medikamente wie Metronidazol, Tinidazol und Nitazoxanid sind die bevorzugten Behandlungsmöglichkeiten für Zwölffingerdarminfektionen [3].Allerdings verursachen diese Chemotherapeutika unerwünschte Nebenwirkungen wie Übelkeit, Karzinogenese und Genotoxizität [4].Daher müssen wirksamere Strategien zur Vorbeugung einer G. duodenalis-Infektion entwickelt werden.
Inflammasome sind eine Klasse zytosolischer Proteinkomplexe, die Teil der angeborenen Immunantwort sind und dabei helfen, sich gegen die Invasion von Krankheitserregern zu verteidigen und Entzündungsreaktionen zu vermitteln [5].Unter diesen Inflammasomen wurde das Nukleotid-bindende Oligomerisierungs-(NOD)-Rezeptor-3-(NLRP3)-Nukleotid-bindende Oligomerisierungs-(NLRP3)-Nukleotid-Bindungsähnliche Inflammasom ausführlich untersucht, da es durch verschiedene Pathogen-/Schadens-assoziierte molekulare Muster (PAMP/ DAMP) erkennt, aktiviert das angeborene Immunsystem.und reguliert die Darmhomöostase bei vielen entzündlichen Erkrankungen [6,7,8].Es besteht aus dem Mustererkennungsrezeptor (PRR) NLRP3, einem Adapter-Apoptotic-Spotted-Protein (ASC) und einem Effektor Procaspase-1 oder Procaspase-11.Das NLRP3-Inflammasom fungiert als Wirt gegen die Invasion von Krankheitserregern, wie in Studien zu Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] und Leishmania beobachtet.[11], aber es wurde auch berichtet, dass die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms schützende Immunantworten einschränkt und das Fortschreiten der Krankheit verschlimmert, beispielsweise bei Würmern [12].Basierend auf unseren früheren Erkenntnissen berichteten wir, dass extrazellulärer G. duodenalis die intrazelluläre Aktivierung der NLRP3-Entzündung auslöst und die Entzündungsreaktionen des Wirts durch die Sekretion extrazellulärer Vesikel (EVs) moduliert [13].Die Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei der G. duodenalis-Infektion in vivo muss jedoch noch bestimmt werden.
Giardine wurden ursprünglich als strukturelle Bestandteile des Zytoskeletts von G. duodenalis beschrieben und spielen eine wichtige Rolle bei der Beweglichkeit von Trophozoiten und der Anheftung von Epithelzellen im Dünndarm.Um sich besser an die Umgebung anzupassen und ihre Pathogenität zu erhöhen, entwickelten G. duodenalis-Trophozoiten eine einzigartige Zytoskelettstruktur, die aus 8 Flagellen, 1 Mittelkörper und 1 Bauchscheibe besteht [14].Die Trophozoiten von Giardia duodenum dringen mit ihrem Zytoskelett in den oberen Dünndarm, insbesondere den Zwölffingerdarm, ein und heften sich an Enterozyten.Sie wandern ständig und heften sich mithilfe des Zellstoffwechsels an Epithelzellen.Daher besteht ein enger Zusammenhang zwischen ihrem Zytoskelett und ihrer Virulenz.Für Giardia duodenum spezifische Giardinen sind Bestandteile der Zytoskelettstruktur [15] und werden in vier Klassen unterteilt: α-, β-, γ- und δ-Giardinen.Es gibt 21 Mitglieder der α-Giardin-Familie, die alle über eine kalziumabhängige Fähigkeit verfügen, Phospholipide zu binden [16].Sie verbinden auch das Zytoskelett mit der Zellmembran.Bei Personen mit durch G. duodenalis verursachtem Durchfall werden α-Giardine während der Infektion stark exprimiert und sind immunreaktiv [17].Heterologe Impfstoffe auf der Basis von Giardia alfa-1 schützten bei Mäusen vor Giardiasis und sind potenzielle Kandidatenantigene für die Impfstoffentwicklung [18].Alpha-8-Giardin, lokalisiert in der Plasmamembran und den Flagellen, jedoch nicht in der ventralen Bandscheibe, steigert die Motilität und Wachstumsrate von Trophozoiten in G. duodenalis [19].Alpha-14-Giardin bindet an Mikrotubulistrukturen auf Flagellen und beeinträchtigt die Lebensfähigkeit von G. duodenalis [20].Alpha-11-Giardine ist während des gesamten Lebenszyklus reichlich vorhanden, und eine Überexpression von Alpha-11-Giardine schädigt G. duodenalis selbst [21].Es ist jedoch unklar, ob Alpha-2-Giardine und Alpha-7.3-Giardine vor einer G. duodenalis-Infektion schützen und welche Mechanismen ihnen zugrunde liegen.
In dieser Studie wurden rekombinante eukaryotische Expressionsplasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine und pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine in primäre Peritonealmakrophagen der Maus transfiziert, um NLRP3 des Wirts zu aktivieren.Anschließend wurden Inflammasom-Ziele gescreent.Wir untersuchten auch die Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei der Pathogenität von G. duodenalis, untersuchten, ob Alpha-2- und Alpha-7,3-Giardine die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in vivo induzieren, und stellten fest, dass diese beiden Rollen von Giardinen bei der Pathogenität von G. duodenalis eine Rolle spielen G. duodenalis.Unser gemeinsames Ziel war die Entwicklung vielversprechender Ziele zur Prävention einer G. duodenalis-Infektion.
Weibliche Wildtyp (WT) C57BL/6-Mäuse im Alter von 5–8 Wochen wurden vom Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, China) gekauft.Mäuse hatten freien Zugang zu Wasser, erhielten sterilisiertes Futter und wurden in einem 12/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten.Vor der Infektion erhielten Mäuse nach Belieben Antibiotika im Trinkwasser, ergänzt mit Ampicillin (1 mg/ml), Vancomycin (1 mg/ml) und Neomycin (1,4 mg/ml) (alle gekauft von künstlichen Organismen aus Shanghai, China) [22 ].].Mäuse, die länger als 24 Stunden nicht mehr essen und trinken konnten und ≥ 20 % ihres Körpergewichts verloren, wurden durch Genickbruch auf humane Weise eingeschläfert.
WB G. duodenalis-Trophozoiten (American Type Culture Collection, Manassas, USA) wurden mit 12,5 % fötalem Rinderserum (FBS; Every Green, Zhejiang, China) und 0,1 % Rindergalle (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ergänzt ).USA) unter mikroaeroben Bedingungen.Konfluente Trophozoiten wurden auf Eis gesammelt und im Verhältnis 1:4 zur weiteren Reproduktion passagiert.
Giardia duodenum-Zysten wurden wie zuvor beschrieben induziert [23], Trophozoiten wurden in der logarithmischen Phase geerntet und dann mit Einkapselungsinduzierendem Medium, pH 7,1 (modifiziertes TYI-S-33), auf eine Endkonzentration von 1 × 106 Trophozoiten/ml verdünnt.Gallenkonzentration 0,05 % mittel).Trophozoiten wurden bis zur logarithmischen Wachstumsphase unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C kultiviert.Wechseln Sie das Medium zu Zysten-induzierendem Medium (pH 7,8; ​​modifiziertes TYI-S-33-Medium mit 1 % Gallenkonzentration) und kultivieren Sie G. duodenalis bei 37 °C für 48–96 Stunden, wobei die Bildung von Zysten unter einem Mikroskop beobachtet wurde.Nachdem die meisten Trophozoiten zur Bildung von Zysten angeregt worden waren, wurde die Kulturmischung geerntet und in sterilem entionisiertem Wasser resuspendiert, um die verbleibenden Trophozoiten zu lysieren.Die Zysten wurden gezählt und bei 4 °C für spätere Analysen über eine Magensonde bei Mäusen gelagert.
Extrazelluläre Vesikel (GEVs) von Giardia wurden wie zuvor beschrieben angereichert [13].Trophozoiten in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in modifiziertem TYI-S-33-Medium, das mit an Exosomen abgereichertem FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) hergestellt wurde, auf eine Endkonzentration von 1 × 106 Parasiten/ml resuspendiert und 12 Stunden lang inkubiert.wurden aus dem Kulturüberstand durch Zentrifugation bei 2000 g für 10 Minuten, 10.000 g für 45 Minuten und 100.000 g für 60 Minuten isoliert.Die Niederschläge wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) quantifiziert und bei –80 °C gelagert oder direkt für weitere Analysen verwendet.
Primäre Peritonealmakrophagen der Maus wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (24).Kurz gesagt, Mäusen (im Alter von 6–8 Wochen) wurden (intraperitoneal [ip]) 2,5 ml 2,98 % flüssiges Thioglykolmedium von Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) injiziert und 3–4 Gaumen gefüttert.Eine Suspension von Makrophagen wurde aus der Bauchhöhle von Mäusen nach der Euthanasie entnommen und dreimal 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert.Die geernteten Zellen wurden durch Durchflusszytometrie unter Verwendung des CD11b-Markers nachgewiesen, bis die Zellreinheit >98 % betrug, dann in Zellkulturplatten mit 6 Vertiefungen (4,5 x 106 Zellen/Vertiefung) gegeben und mit 10 % FBS (Bioindustry) bei 37 °C inkubiert.und 5 % CO2.
RNA wurde aus 1 × 107 Trophozoiten in 1 ml TRIzol-Reagenz (Vazyme, Nanjing, China) extrahiert, genomische DNA wurde aus der gesamten G. duodenalis-RNA unter Verwendung von MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) extrahiert und komplementäre DNA (cDNA) wurde synthetisiert Verwenden Sie MonScript RTIIII Super Mix (Monad) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
CDS-Sequenzinformationen für das Zielgen von G. duodenalis wurden von der NCBI GenBank erhalten.Verwenden Sie Primer 5.0, um spezifische nahtlose Klonierungsprimer für jedes Zielgen zu entwerfen.Der Vorwärtsprimer (5′-3′) besteht aus drei Teilen: einer überlappenden Sequenz mit einem linearisierten Vektor pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) und den Startcodons ATG und GNN (wenn die erste Base nicht G ist).Dies geschieht, um die Effizienz des Ausdrucks zu verbessern.Zusätzlich mindestens 16 bp kombinierte Basen (GC-Gehalt 40–60 %/Tm ca. 55 °C).Der Rückwärtsprimer (5′-3′) besteht aus zwei Teilen, einer überlappenden Sequenz mit einem EcoRV-linearisierten Vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) und einer kombinierten Base von mindestens 16 bp.(mit Ausnahme der letzten beiden Haltestellen).Basen) ein Codon wie AA oder GA, damit rekombinante Plasmide ihre markierten Proteine ​​exprimieren können.Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt und wurden von Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China) synthetisiert.
Die Ziele wurden unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase (Tiangen, Peking, China) oder Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, China) unter Verwendung vorbereiteter G. duodenalis-cDNA als Matrize amplifiziert.Das eukaryotische Expressionsvektorplasmid pcDNA3.1(+) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV linearisiert und unter Verwendung von Fast AP (Thermo Fisher Scientific) dephosphoryliert.Linearisierte pcDNA3.1(+)-Fragmente und amplifizierte Zielgenfragmente wurden mit einem DNA-Gel-Reinigungskit (Tiangen) gereinigt und mit einem Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert.Das pcDNA3.1(+)-Fragment und jedes Zielgenfragment wurden unter Verwendung eines MonClone Single Assembly Cloning Mix (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) rekombiniert und durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) bestätigt..
Die endotoxinfreien Plasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 und pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 wurden mit dem SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) erzeugt.Die Konzentration wurde über 500 ng/µl gehalten, um sicherzustellen, dass das EDTA im Elutionspuffer den Transfektionstest nicht beeinträchtigte.Primäre Maus-Peritonealmakrophagen wurden in 6-Well-Platten mit vollständigem RPMI 1640-Medium (Biological Industries) 12 Stunden lang kultiviert, dann wurden die Zellen dreimal in warmem PBS gewaschen, um Penicillin und Streptomycin zu entfernen, und dann in Medium, das mit vollständigem Medium ergänzt war.Endotoxinfreie Plasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 und pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) wurden in 125 μl Opti-MEM-reduziertem Serummedium (Gibco, Thermo Fisher Scientific) verdünnt..Dann wurden 5 µl Lipofectamine 2000-Transfektionsreagenz (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) in 125 µl Opti-MEM-Medium mit niedrigem Serumgehalt verdünnt.Bereiten Sie Liposom-DNA-Komplexe vor, indem Sie das verdünnte endotoxinfreie Plasmid mit Lipofectamine 2000 mischen und die Mischung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen lassen.Übertragen Sie die Komplexe getrennt auf die Zellen in jeder Vertiefung und mischen Sie sie langsam.Nach 4 Stunden wurde das Zellkulturmedium durch 2 ml vollständiges RPMI 1640-Medium ersetzt und die Kultur wurde 24 Stunden lang fortgesetzt.Den Zellen wurde frisches Zellkulturmedium zugesetzt und je nach Testdesign für verschiedene Zeitpunkte inkubiert.
Proteinproben aus Überständen und Zelllysaten wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (25).Die Membrantransferparameter für Pro-IL-1β, Pro-Caspase-1, Caspase-1 p20, NLRP3, β-Actin und His-Tag betrugen 200 mA/90 Min.Für Interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), Caspase-1 (p20) (Adipogen, Schweiz) und NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Schweiz) und 1:5000 für den His-Tag (Amylet Scientific, Wuhan, China) und β-Aktin (Proteintech, Wuhan, China).
Die Vernetzung mit Disuccinimidsuberat (DSS) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [26].Die Zellen wurden dreimal mit kaltem PBS gewaschen und mit einer 27-Gauge-Nadel in 50 µl ASC-Reaktionspuffer (pH 8,0), der 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES und 125 mM NaHCO3 enthielt, vollständig lysiert.Die Mischung wurde 3 Minuten lang bei 5000 g zentrifugiert und das Pellet wurde mit 10 µl DSS (25 mM in DMSO) und 40 µl ASC-Reaktionspuffer 30 Minuten lang bei 37 °C vernäht.Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 5000 g wurde das Pellet in einer Lösung aus 40 µl ASC-Reaktionspuffer und 10 µl 6x Protein-Beladungspuffer (TransGen, Peking, China) gelöst und dann wurde die Lösung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gequencht Mindest., Dann 10 Minuten kochen lassen.Anschließend wurden die Proteinproben einem Western Blot unter Verwendung primärer Anti-ASC-Antikörper (Wanleibio, Shenyang, China) in einem Verdünnungsverhältnis von 1:500 unterzogen.
Nach einem zuvor beschriebenen Verfahren [13] wurden Zellkulturüberstände geerntet und die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-1β mit dem Maus-IL-1-Beta-ELISA-Kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) bestimmt.Konvertieren Sie OD450nm-Werte mithilfe der IL-1β-Standardkurve in Proteinkonzentrationen.
Auf Deckgläser beschichtete Zellen wurden dreimal vorsichtig in warmem PBS gewaschen, 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in Gewebezellfixiermittel (Biosharp, Peking, China) in 0,1 % Triton X-Permeabilize bei 100 (verdünnt in PBS; Biosharp) fixiert ) für 20 Minuten bei Raumtemperatur und Blockierung in 5 % Rinderserumalbumin (in PBS) für 2 Stunden bei Raumtemperatur.Die Zellen wurden dann über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen ASC (1:100-Verdünnung) bzw. NLRP3 (1:100-Verdünnung) und Cy3-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG(H+L) (1:400; EarthOx) inkubiert , San Francisco, CA, USA) oder FITC-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:400; Earthox) über Nacht bei 37 °C im Dunkeln für 1 Stunde.Die Kerne wurden 5 Minuten lang mit Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) angefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus Corporation, Tokio, Japan) beobachtet.
Die Mäuse wurden in vier Gruppen eingeteilt (n = 7 in jeder Gruppe): (i) PBS-behandelte negative Kontrollgruppe (nur PBS; Sondenernährung 100 µl/Maus-PBS, gefolgt von täglicher intraperitonealer Injektion von 100 µl/Maus-PBS 3 Stunden später)., ununterbrochen für 7 Tage);(ii) negative Kontrollgruppe, behandelt mit MCC950-Inhibitor [27] (100 µl/Maus über eine PBS-Sonde, 3 Stunden später wurden 10 mg/kg Körpergewicht [BW] MCC950 [in PBS] täglich intraperitoneal verabreicht, Dauer 7 Tage);(iii) G. duodenalis-Zysteninfektionsgruppe (1,5 x 106 Zysten/Maus durch Sondenernährung, 3 Stunden später, 100 μl/Maus PBS intraperitoneal täglich über 7 Tage verabreicht);(iv) G. duodenalis-Zysten-Kombinationsinfektionsgruppe, MCC950-Inhibitor-Behandlungsgruppe (1,5 × 106 Zysten/Maus über eine Sonde, 10 mg/kg Körpergewicht MCC950 intraperitoneal täglich für 7 Tage bei 3 Stunden).Das Körpergewicht jeder Maus wurde täglich überwacht und alle Mäuse wurden am 7. Tag eingeschläfert.Der geerntete Zwölffingerdarm (3 cm lang) wurde in 1 ml PBS in kleine Stücke geschnitten, die Zysten wurden über Nacht in PBS bei 4 °C zerstört und G. duodenalis-Trophozoiten.Für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) wurde frischer Zwölffingerdarm (1 cm lang) isoliert.
Die Mäuse wurden in zwei Gruppen eingeteilt: (i) MOCK-Kontrollgruppe und (ii) MCC950-Inhibitorgruppe.In jeder Gruppe gab es fünf Behandlungen (n = 7/Behandlungsgruppe): (i) Negativkontrollgruppe mit PBS-Behandlung (nur PBS; 100 µl/Maus PBS, intramuskuläre (IM) Injektion (Tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+)-Plasmid-Negativkontrollgruppe (100 µg/Maus-DNA, über intramuskuläre Injektion); (iii) Positivkontrollgruppe für G. duodenalis-Zysteninfektion (1,5 x 106 Zysten/Maus, über Sonde) (iv) a Gruppe, die mit dem Plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/Maus-DNA, durch intramuskuläre Injektion) behandelt wurde, und (v) eine Gruppe, die mit dem Plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/Maus) behandelt wurde Nach 12-stündiger Passage der DNA erhielten Mäuse in der MCC950-Inhibitorgruppe 7 Tage lang täglich eine intraperitoneale Injektion von MCC950 (10 mg/kg Körpergewicht), während Mäuse in der MOCK-Gruppe eine gleiche Menge PBS-Behandlung erhielten Von den Augäpfeln der Mäuse gesammelt und über Nacht bei 4 °C belassen, wurden Serumproben mithilfe eines Enzymimmunoassays (ELISA) isoliert und der IL-1β-Spiegel gemessen.
35 Mäuse wurden in fünf Gruppen eingeteilt (n=7/Gruppe).Gruppe 1 war eine negative Kontrollgruppe, die mit PBS behandelt wurde: Mäuse erhielten 100 μl PBS intramuskulär und 3 Tage später per Sonde.Gruppe 2 ist eine positive Kontrollgruppe, die mit G. duodenalis-Zysten infiziert ist: Den Mäusen wurden 100 μl PBS injiziert, und 3 Tage später wurden 1,5 x 106 Zysten/Maus intragastrisch injiziert.Dritte Gruppe – Plasmidimmunisierung mit pcDNA3.1(+) in Kombination mit einer Kontrollgruppe für Zwölffingerdarmzysteninfektion: Mäuse erhielten 100 μg Plasmid-DNA pcDNA3.1(+)(im) oral, 1,5×106 Zysten/Maus 3 für mehrere Tage.Die Gruppen 4 und 5 waren rekombinantes pcDNA3.1(+)-alpha-2-Giardine-Plasmid oder pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-Giardine-Plasmid in Kombination mit einer G. duodenalis-Zysteninfektion.Versuchsgruppe: Mäuse erhielten 100 µg pcDNA3.1(+)-Giardine-Plasmid-DNA (im), dann 3 Tage später wurden 1,5 × 106 Zysten/Maus per Sonde injiziert.Das Körpergewicht jeder Maus wurde nach Einführung der G. duodenalis-Zyste durch das Röhrchen überwacht.Zur Messung der parasitären Belastung und zur HE-Färbungsanalyse wurde frischer Zwölffingerdarm entnommen.
Histopathologische Veränderungen wurden nach einem zuvor veröffentlichten Verfahren analysiert [30].Frischer Zwölffingerdarm wurde mit Gewebezellfixiermittel fixiert, in Paraffin eingebettet, in 4 μm-Schnitte geschnitten, mit H&E gefärbt und unter einem Lichtmikroskop analysiert.Repräsentative pathologische Veränderungen in sieben Gewebeschnitten von sieben unabhängigen Mäusen wurden von einem Pathologen, der nichts von der Behandlung wusste, beurteilt und mit 200-facher Vergrößerung erfasst.Die Länge der Zotten und die Tiefe der Krypten wurden gemäß den zuvor beschriebenen Methoden gemessen.
Die Ergebnisse in vitro und in vivo wurden in dreifacher Ausfertigung erhalten.Diagramme wurden mit GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) erstellt.Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden durch einen T-Test analysiert, während Unterschiede zwischen ≥3 Gruppen durch eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung der SPSS-Software (Version 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) analysiert wurden.Die Daten wurden mithilfe des Levene-Tests und anschließend des Bonferronis-Post-hoc-Tests (B) auf Homogenität der Varianz analysiert.Die Signifikanz wird ausgedrückt als P<0,05, P<0,01 und P<0,001 (nicht signifikant [ns]) (P>0,05).
Unsere vorherige Analyse der GEV-Proteomik in der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) zeigte, dass viele Ziele an der Aktivierung entzündlicher Signalwege beteiligt sein könnten [13].Wir haben zwei vielversprechende Ziele ausgewählt, Alpha-2- und Alpha-7.3-Giardine, diese Moleküle amplifiziert und sie zur Konstruktion des eukaryotischen Expressionsvektors pcDNA3.1(+) verwendet.Nach der Sequenzierung wurden rekombinante pcDNA3.1(+)-alpha-2- und alpha-7.3-Giardine-Expressionsplasmide in primäre Peritonealmakrophagen der Maus transfiziert und das Caspase-1-p20-Signaturprotein der Entzündung (ein Fragment der aktivierten Caspase-1) identifiziert als Schlüsselmoleküle aufzuklären, die Entzündungen auslösen können.Die Ergebnisse zeigten, dass Alpha-2- und Alpha-7.3-Giardine eine p20-Caspase-1-Expression ähnlich wie GEV induzieren können.Bei der unbehandelten Negativkontrolle (nur PBS) und der Plasmidkontrolle pcDNA3.1(+) wurde keine Auswirkung auf die Caspase-1-Aktivierung festgestellt (Abbildung 1).
Messung der p20-Caspase-1-Aktivierung durch pcDNA3.1(+)-alpha-2- und alpha-7.3-Giardine.Rekombinante eukaryotische Expressionsplasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 und alpha-7.3 Giardines (über jeder Spur) wurden in primäre Peritonealmakrophagen der Maus transfiziert und Kulturüberstände wurden 24 Stunden später geerntet.Western Blot wurde verwendet, um die Expressionsniveaus des charakteristischen Caspase-1-p20-Inflammasom-Proteins zu messen.Die reine PBS-Behandlungsgruppe (Spur C) und die pcDNA3.1(+)-Monotherapiegruppe (pcDNA3.1-Spur) wurden als Negativkontrolle und die GEV-Behandlungsgruppe als Positivkontrolle verwendet.Die Expression des rekombinanten Proteins wurde durch den Nachweis eines Histidin-Tags in jedem Protein bestätigt, und die erwarteten Proteinbanden waren Alpha-2-Giardine (38,2 kDa) und Alpha-7,3-Giardine (37,2 kDa).GEV, extrazelluläre Vesikel von Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearisierter Vektor, SUP, Überstand
Um festzustellen, ob Alpha-2-Giardine und Alpha-7.3-Giardine die p20-Caspase-1-Expression induzieren und eine Rolle bei der Aktivierung der NLRP3-Entzündungsreaktion des Wirts spielen, pcDNA3.1(+)-alpha-2-Giardine und pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 Giardin wurde mit rekombinanter Plasmid-DNA in primäre Peritonealmakrophagen der Maus transfiziert und die Expressions-, Lokalisierungs- und Oligomerisierungsniveaus der wichtigsten Entzündungsproteine ​​NLRP3 bestimmt.In diesem Experiment wurde GEV als positive Kontrollgruppe verwendet und die Gruppe ohne Behandlung (nur PBS) oder die Gruppe mit pcDNA3.1(+)-Transfektionsbehandlung war die negative Gruppe.Die Ergebnisse zeigten, dass, wie in der GEV-Gruppe, rekombinante Plasmid-DNA von Giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 und Giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 zu einer Hochregulierung von NLRP3, Pro-IL-1β und führte Procaspase-1 und Caspase-1-Aktivierung (Abb. 2a).Darüber hinaus induzierten beide Giardine eine signifikante IL-1β-Sekretion (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; Alpha-2-Giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;Alpha-7,3-Giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Abbildung 2b).Die meisten ASC-Proteine ​​waren in der Gruppe ohne Behandlung oder in der Behandlungsgruppe, die mit dem pcDNA3.1(+)-Plasmid transfiziert wurde, im Gegensatz zu pcDNA3.1(+)-alpha-2 oder pcDNA3.1(+)-alpha- 7,3 Giardine.Die ASC-Oligomerisierung erfolgte in der rekombinanten Plasmid-DNA der GEV-positiven Kontrollgruppe oder -gruppe und zeigte eine oligomere Form (Abbildung 2c).Diese vorläufigen Daten legen nahe, dass Alpha-2-Giardin und Alpha-7,3-Giardin die Aktivierung von NLRP3-Entzündungen induzieren können.Nachfolgende Immunfluoreszenzstudien zur Lokalisierung von ASC und NLRP3 zeigten, dass in der Negativkontrollgruppe das ASC-Protein im gesamten Zytoplasma verstreut war und bei Stimulation von pcDNA3.1(+)-alpha-2 mit Giardine oder pcDNA3 als Punktsignal erschien.1(+)-alpha-7,3-Giardine-Gruppe oder GEV-positive Kontrollgruppe (Abbildung 2d).In der Negativkontrolle und den mit Plasmid behandelten pcDNA 3.1-Gruppen wurde das NLRP3-Proteinsignal nicht erkannt, während ein fluoreszierender Signalpunkt als Reaktion auf pcDNA3.1(+)-alpha-2 Giardine oder pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 auftrat wurde festgestellt..Giardine werden im Zytoplasma oder bei Stimulation des HEV gefunden (Abb. 2e).Diese Daten zeigen weiter, dass G. duodenalis Giardin Alpha-2 und Giardin Alpha-7.3 das NLRP3-Inflammasom in primären Peritonealmakrophagen der Maus aktivieren.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 Giardin und pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 Giardin aktivieren das NLRP3-Inflammasom in Peritonealmakrophagen der Maus.Transfizieren Sie die rekombinanten eukaryotischen Expressionsplasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin und pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin in primäre peritoneale Makrophagen und Zellen der Maus oder ernten Sie den Überstand innerhalb von 24 Stunden zur Analyse der Expression und Oligomerisierung , Sekretion.und Lokalisierung wichtiger Entzündungsproteine.Die reine PBS-Gruppe (C) und die pcDNA3.1(+)-Einzelbehandlungsgruppe wurden als Negativkontrolle verwendet, und die GEV-Behandlungsgruppe wurde als positive Gruppe verwendet.a Die wichtigsten Entzündungsproteine ​​NLRP3, einschließlich NLRP3, Pro-IL-1β, Pro-Caspase-1 und p20-Caspase-1, wurden durch Western Blot nachgewiesen.b Die Sekretionsniveaus von IL-1β in den Überständen wurden mithilfe eines Enzymimmunoassays (ELISA) bestimmt.Unterschiede zwischen Kontroll- und Versuchsgruppen wurden durch einseitige Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung der SPSS-Softwareversion 22.0 analysiert.Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen **P<0,01 und ***P<0,001.c Die ASC-Oligomerisierungsniveaus in Pellets wurden durch DSS-Vernetzungsanalyse bestimmt, während die ASC-Niveaus in Zelllysaten als Beladungskontrolle verwendet wurden.d Visualisierung der ISC-Lokalisierung mittels Immunfluoreszenz.e Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die Lokalisierung von NLRP3 sichtbar zu machen.ASC, apoptotisches speckartiges Protein;IL, Interleukin;NLRP3, Nukleotid-bindender Oligomerisierungs-ähnlicher Rezeptor 3;ns, nicht signifikant (P > 0,05)
Sowohl G. duodenalis als auch die von ihm sezernierten GEVs aktivieren das NLRP3-Inflammasom und regulieren die Entzündungsreaktionen des Wirts in vitro.Daher bleibt die Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei der Pathogenität von G. duodenalis unklar.Um dieses Problem zu untersuchen, haben wir ein Experiment zwischen Mäusen, die mit einer G. duodenalis-Zyste infiziert waren, und Mäusen, die mit einer G. duodenalis-Zyste + MCC950-Inhibitor-Behandlung infiziert waren, entworfen und die NLRP3-Inflammasom-Expression bei einer Infektion mit einer G. duodenalis-Zyste verglichen.Ein detailliertes Schema des Experiments ist in Abb. 3a dargestellt.Veränderungen des Körpergewichts von Mäusen in verschiedenen Behandlungsgruppen wurden 7 Tage nach der Infektion mit Zysten überwacht und die Ergebnisse sind in Abb. 3b dargestellt.Im Vergleich zur mit reinem PBS behandelten Gruppe zeigten die Ergebnisse, dass (i) das Körpergewicht der mit G. duodenalis-Zysten infizierten Mäuse vom 3. bis zum 7. Tag nach der Infektion abnahm;(ii) Die Behandlung mit dem MCC950-Inhibitor hatte keinen signifikanten Einfluss auf das Körpergewicht der Mäuse..Im Vergleich zur Einzelinfektionsgruppe verringerte sich das BW der mit MCC950 behandelten Zwölffingerdarminfektionsgruppe in unterschiedlichem Maße (Tag 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Tag 2: ANOVA, F( 3, 24). ) = 0,4602, P<0,0001; Tag 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Tag 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; Tag 5: ANOVA, F (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Tag 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; Tag 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Diese Daten zeigen, dass das NLRP3-Inflammasom Mäuse in den frühen Stadien (2–4 Tage) einer Zwölffingerdarminfektion vor einem erheblichen Gewichtsverlust schützt.Unser Ziel war es dann, G. duodenalis-Trophozoiten in der Zwölffingerdarmspülflüssigkeit nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3c dargestellt.Im Vergleich zur G. duodenalis-Zysteninfektionsgruppe stieg die Anzahl der Trophozoiten im Zwölffingerdarm nach Blockierung des NLRP3-Inflammasoms signifikant an (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Mit HE gefärbtes Zwölffingerdarmgewebe zeigte im Vergleich zur Negativkontrolle, die nur mit PBS und MCC950 behandelt wurde: (i) Eine G. duodenalis-Zysteninfektion führte zu einer Schädigung der Zwölffingerdarmzotten (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488). ) und Kryptatrophie (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) Zwölffingerdarm von Mäusen, die mit G. duodenalis-Zysten infiziert und mit MCC950-Inhibitoren behandelt wurden.Zwölffingerdarmzotten waren beschädigt und tot (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) mit Atrophie und Kryptaverzweigung (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Abb. 3d- F) .Diese Ergebnisse legen nahe, dass das NLRP3-Inflammasom eine Rolle bei der Verringerung der Pathogenität von G. duodenalis spielt.
Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei der Infektion mit Giardia duodenum.Den Mäusen wurden Duodenokokkenzysten per Magensonde verabreicht (iv) und dann mit oder ohne MCC950 (ip) behandelt.Als Kontrollen dienten einzelne Behandlungsgruppen mit PBS oder MCC950.Versuchsgruppe und Behandlungsschema.b Das Körpergewicht der Mäuse in jeder der verschiedenen Behandlungsgruppen wurde 7 Tage lang überwacht.Der Unterschied zwischen der G. duodenalis-Infektionsgruppe und der G. duodenalis + MCC950-Infektionsbehandlungsgruppe wurde mittels T-Test unter Verwendung der SPSS-Softwareversion 22.0 analysiert.Sternchen zeigen signifikante Unterschiede bei *P<0,05, **P<0,01 oder ***P<0,001 an.c Die parasitäre Belastung wurde durch Zählen der Anzahl der Trophozoiten in der Zwölffingerdarmspülflüssigkeit bestimmt.Der Unterschied zwischen der G. duodenalis-Infektionsgruppe und der G. duodenalis + MCC950-Infektionsbehandlungsgruppe wurde mittels T-Test unter Verwendung der SPSS-Softwareversion 22.0 analysiert.Sternchen zeigen signifikante Unterschiede bei *P < 0,05 an.d Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsergebnisse (H&E) der duodenalen Histopathologie.Rote Pfeile deuten auf Schäden an den Zotten hin, grüne Pfeile auf Schäden an den Krypten.Maßstabsleiste: 100 µm.e, f Statistische Analyse der Höhe der Zwölffingerdarmzotten und der Kryptahöhe der Maus.Sternchen zeigen signifikante Unterschiede bei *P<0,05 und **P<0,01 an.Die Ergebnisse stammen aus 7 unabhängigen biologischen Experimenten.BW, Körpergewicht;IG, intragastrischer Verabreichungsweg;ip, intraperitonealer Verabreichungsweg;ns, nicht signifikant (P > 0,05);PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung;WT, Wildtyp
Die Sekretion von IL-1β ist ein Kennzeichen der Entzündungsaktivierung.Um zu bestimmen, ob G. duodenalis Alpha-2-Giardine und Alpha-7.3-Giardine das NLRP3-Wirts-Inflammasom in vivo aktivieren, verwendeten wir unbehandelte WT-Mäuse (Scheingruppe) und NLRP3-Inflammasom-blockierte Mäuse (MCC950-inhibierte Behandlungsgruppe).Ein detailliertes Schema des Experiments ist in Abb. 4a dargestellt.Die Versuchsgruppen bestanden aus Mäusen, die mit PBS, G. duodenalis-Zystenbehandlung durch Sondenernährung, intramuskulärer Injektion von pcDNA3.1 und intramuskulärer Injektion von pcDNA3.1(+)-alpha-2-Giardin oder pcDNA3.1-alpha-7.3-Giardin behandelt wurden.Am 7. Tag nach der intramuskulären Verabreichung des rekombinanten Plasmids wurde Serum gesammelt und der IL-1β-Spiegel in jeder Gruppe bestimmt.Wie in Abbildung 4b gezeigt, hatte die MOCK-Gruppe (i) im Vergleich zur PBS-Gruppe keine signifikante Auswirkung auf die IL-1β-Sekretion (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), jedoch Die IL-β-Sekretion war in der G. duodenalis-Zystengruppe signifikant erhöht (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 Giardine und pcDNA3.1- Die intramuskuläre Injektion von Alpha-7,3-Giardin erhöhte die Serum-IL-1β-Spiegel signifikant (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3-Giardin induzierte ein hohes Maß an IL-1β-Sekretion in der Gruppe mit intramuskulärer Injektion von pcDNA3.1-alpha-2-Giardin (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Verglichen mit jeder Gruppe in der MCC950-Behandlungsgruppe und der MOCK-Gruppe: (i) Die IL-1β-Sekretionsniveaus in der PBS-Kontrollgruppe und der pcDNA3.1-Kontrollgruppe gingen nach der Blockierung des MCC950-Inhibitors bis zu einem gewissen Grad zurück, der Unterschied bestand jedoch nicht signifikant (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) nach dem Blockieren von MCC950.Die IL-1β-Sekretion war in der mit G. duodenalis-Zysten infizierten Gruppe, der pcDNA3.1-alpha-2-Giardine-Gruppe und der pcDNA3.1-alpha-7.3-Giardine-Gruppe signifikant reduziert (G. duodenalis: ANOVA, F(9). , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alpha-2 Giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alpha-7,3 Giardine: ANOVA, F(9, 58 ) = 3,540, P = 0,0164).Diese Ergebnisse legen nahe, dass Alpha-2-Giardin und Alpha-7.3-Giardin die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in vivo vermitteln.
pcDNA3.1(+)-Giardine aktivieren das NLRP3-Wirts-Inflammasom in vivo.Mäuse wurden mit dem rekombinanten eukaryotischen Expressionsplasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine oder pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine immunisiert (IM) und dann mit MCC950 (ip; MCC950-Gruppe) behandelt oder nicht (Dummy-Gruppe). ).Die PBS- oder pcDNA3.1(+)-Plasmid-Behandlungsgruppe wurde als Negativkontrolle verwendet, die G. duodenalis-Zysten-Behandlungsgruppe wurde als Positivkontrolle verwendet.Versuchsgruppe und Behandlungsschema.b Die Serumspiegel von IL-1β bei Mäusen wurden am Tag 7 mittels ELISA-Assay gemessen.Unterschiede zwischen Gruppen in der MOCK-Gruppe wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA analysiert, und Unterschiede zwischen der MOCK-Gruppe und der MCC950-Gruppe wurden mithilfe des t-Tests der SPSS-Softwareversion 22.0 analysiert.Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen in der MOCK-Gruppe an, *P<0,05 und ***P<0,001;Dollarzeichen ($) weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen in der MOCK-Gruppe und der MCC950-Gruppe bei P<0,05 hin.Ergebnisse von sieben unabhängigen biologischen Experimenten.i, intramuskuläre Injektion, ns, nicht signifikant (P > 0,05)
Um die Wirkung der durch Alpha-2- und Alpha-7.3-Giardine vermittelten Aktivierung des NLRP3-Wirts-Inflammasoms auf die Infektiosität von G. duodenalis zu untersuchen, verwendeten wir WT C57BL/6-Mäuse und injizierten Alpha-2-Giardin und Alpha-7.3-Giardin.Das Plasmid wurde intramuskulär nach 3 Tagen durch die Magensonde der G. duodenalis-Zyste injiziert, wonach die Mäuse 7 Tage lang beobachtet wurden.Ein detailliertes Schema des Experiments ist in Abb. 5a dargestellt.Das Körpergewicht jeder Maus wurde jeden Tag gemessen, am 7. Tag nach der Verabreichung über eine Magensonde wurden frische Zwölffingerdarmgewebeproben entnommen, die Anzahl der Trophozoiten gemessen und histopathologische Veränderungen beobachtet.Wie in Abbildung 5b dargestellt, nahm das BW der Mäuse in jeder Gruppe mit zunehmender Fütterungszeit allmählich zu.Die MT von Mäusen begann am 3. Tag nach der intragastrischen Verabreichung von G. duodenalis-Zysten zu sinken und stieg dann allmählich an.Die durch intramuskuläre Injektion von Alpha-2-Giardine und Alpha7.3-Giardine induzierte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms schwächte den Gewichtsverlust bei Mäusen deutlich ab (Tag 1: pcDNA3.1-alpha-2-Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Tag 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Tag 2: pcDNA3.1-alpha-2 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Tag 2: pcDNA3.1-alpha-7,3 Giardine, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; Tag 3: pcDNA3.1-alpha-2 Giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Tag 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083; Tag 4: pcDNA3.1-alpha-2 Giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Tag 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Tag 5: pcDNA3.1-alpha - 2 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Tag 5: pcDNA3.1-alpha -7,3 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Tag 6: pcDNA3 .1 - alpha-2 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Tag 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Tag 7: pcDNA3.1-alpha-2 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Tag 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Die parasitäre Belastung wurde im Zwölffingerdarm beurteilt (Abb. 5c).Im Vergleich zur unbehandelten Positivkontrolle und der Gruppe, der der leere pcDNA3.1-Vektor injiziert wurde, war die Anzahl der G. duodenalis-Trophozoiten in den Gruppen, denen α-2-Giardine und α-7,3-Giardine (pcDNA3.1-alpha) injiziert worden waren, signifikant reduziert -2 Giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7,3 Giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Darüber hinaus war Giardine alfa-7.3 bei Mäusen schützender als Giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Die Ergebnisse der HE-Färbung sind in Abb. dargestellt.5d–f.Mäuse, denen Alpha-2-Giardine und Alpha-7.3-Giardine injiziert wurden, wiesen im Vergleich zu Mäusen, denen G. duodenalis injiziert worden war, und Mäuse, denen G. duodenalis in Kombination mit einem leeren pcDNA3-Vektor injiziert worden war, weniger Läsionen des Zwölffingerdarmgewebes auf, die sich in Zottenschädigungen manifestierten.1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 Giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 oder P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7,3 Giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 oder P = 0,0055) und reduzierte Kryptatrophie (pcDNA3.1-alpha-2 Giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 oder P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 oder P = 0,0191).Diese Ergebnisse legen nahe, dass Alpha-2-Giardin und Alpha-7,3-Giardin die Infektiosität von G. duodenalis verringern, indem sie das NLRP3-Inflammasom in vivo aktivieren.
Rolle von pcDNA3.1(+)-Giardinen bei G. duodenalis-Infektionen.Mäuse wurden mit rekombinanten eukaryotischen Expressionsplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine oder pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine immunisiert (IM) und dann mit G. duodenalis-Zysten (ig) in Kontakt gebracht.Die PBS-Gruppe und die pcDNA3.1(+) + Zwölffingerdarmzysten-Behandlungsgruppe wurden als negative Kontrollgruppen verwendet, und die Zwölffingerdarmzysten-Behandlungsgruppe wurde als positive Kontrollgruppe verwendet.Versuchsgruppe und Behandlungsschema.b Die MT der Mäuse in jeder der verschiedenen Behandlungsgruppen wurde 7 Tage nach der Exposition überwacht.Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen in der G. duodenalis-Gruppe und der pcDNA3.1(+)-alpha-2 Giardine-Gruppe an: *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001;Das Dollarzeichen ($) zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen jeder Gruppe von G. duodenalis und der pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 Jardine-Gruppe an, $$P<0,01 und $$$P<0,001.c Die Parasitenbelastung wurde durch Zählen der Anzahl der Trophozoiten in 1 ml Zwölffingerdarmspülung aus dem Zwölffingerdarm (3 cm lang) bestimmt und als Anzahl der Parasiten pro cm Zwölffingerdarm ausgedrückt.Unterschiede zwischen der G. duodenalis-Infektionsgruppe, der pcDNA3.1(+)-alpha-2-Giardine-Gruppe und der pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-Giardine-Gruppe wurden durch einfaktorielle ANOVA unter Verwendung der SPSS-Softwareversion 22.0 analysiert.Sternchen zeigen signifikante Unterschiede bei **P<0,01 und ***P<0,001 an.d Histopathologische Veränderungen im Duodenum.Rote Pfeile deuten auf Schäden an den Zotten hin, grüne Pfeile auf Schäden an den Krypten.Maßstabsleiste: 100 µm.e, f Statistische Analyse der Zwölffingerdarmzottenhöhe (e) und der Kryptahöhe (f) bei Mäusen.Die Unterschiede zwischen den Gruppen in Abbildung 1d wurden durch eine einfache ANOVA mit der SPSS-Softwareversion 22.0 analysiert.Sternchen zeigen signifikante Unterschiede bei *P<0,05 und **P<0,01 an.Ergebnisse von sieben unabhängigen biologischen Experimenten.ns, nicht signifikant (P > 0,05)
Giardia duodenum ist ein bekannter Darmparasit des Menschen und anderer Säugetiere, der Giardiasis verursacht.Im Jahr 2004 wurde es aufgrund seiner hohen Prävalenz über 6 Jahre, insbesondere in Gemeinden mit niedrigem sozioökonomischen Status, in die WHO-Initiative für vernachlässigte Krankheiten aufgenommen [32].Das angeborene Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort auf eine G. duodenalis-Infektion.Es wurde berichtet, dass Mausmakrophagen G. duodenalis verschlingen und töten, indem sie extrazelluläre Fallen freisetzen [33].Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass G. duodenalis, ein nicht-invasiver extrazellulärer Parasit, die Entzündungssignalwege p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 und NLRP3 in Mausmakrophagen aktiviert, um die Entzündungsreaktionen des Wirts zu regulieren, und freigesetztes GEV kann diesen Prozess verstärken.13], 24].Die genauen PAMPs, die an der durch das NLRP3-Inflammasom regulierten Entzündung bei GEV beteiligt sind, und die Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei Giardiasis müssen jedoch noch geklärt werden.Um diese beiden Fragen zu klären, haben wir diese Studie durchgeführt.
Das NLRP3-Inflammasom befindet sich im Zytoplasma von Immunzellen und kann durch verschiedene Partikel wie Harnsäurekristalle, Toxine, Bakterien, Viren und Parasiten aktiviert werden.In bakteriellen Studien wurden Toxine als wichtige PAMPs identifiziert, die Entzündungssensoren aktivieren und zu Entzündungen und Zelltod führen [34].Einige strukturell unterschiedliche Toxine, wie Hämolysin aus Staphylococcus aureus [35] und Escherichia coli [36], Hämolysin BL (HBL) aus Enterotoxin (NHE) [37], induzieren die Aktivierung der NLRP3-Entzündung.Virale Studien haben gezeigt, dass Virulenzproteine ​​wie das SARS-COV-2-Hüllprotein (E) [38] und das Zika-Virus-NS5-Protein [39] wichtige PAMPs sind, die vom NLRP3-Rezeptor erkannt werden.In Parasitenstudien wurde berichtet, dass viele Parasiten mit der Aktivierung des Inflammasoms des Wirts in Zusammenhang stehen, wie z. B. Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] und Leishmania [42].Die dichten Granulatproteine ​​GRA35, GRA42 und GRA43, die mit der Virulenz von Toxoplasma gondii assoziiert sind, sind für die Induktion von Pyroptose in Lewis-Ratten-Makrophagen erforderlich [43].Darüber hinaus haben sich einige Leishmania-Studien auf einzelne Moleküle konzentriert, die am NLRP3-Inflammasom beteiligt sind, wie etwa Lipophosphoglycan der Parasitenmembran [44] oder Zinkmetalloprotease [45].Unter der Annexin-ähnlichen Alpha-Giardin-Genfamilie wurde gezeigt, dass Alpha-1-Giardin ein potenzieller Impfstoffkandidat ist, der in einem Mausmodell Schutz gegen G. duodenalis bietet [18].In unserer Studie haben wir G. duodenalis-Virulenzfaktoren Alpha-2 und Alpha-7,3-Giardinen ausgewählt, die nur bei Giardien vorkommen, über die aber relativ selten berichtet wird.Diese beiden Zielgene wurden zur Analyse der Entzündungsaktivierung in den Vektor des eukaryotischen Expressionssystems pcDNA3.1(+) kloniert.
In unserem Mausmodell dienen gespaltene Caspase-Fragmente als Marker für die Entzündungsaktivierung.Bei Stimulation interagiert NLRP3 mit ASC, rekrutiert Procaspasen und erzeugt aktive Caspasen, die Pro-IL-1β und Pro-IL-18 in reifes IL-1β bzw. IL-18 spalten.Entzündliche Caspasen (Caspasen-1, -4, -5 und -11) sind eine konservierte Familie von Cysteinproteasen, die für die angeborene Abwehr von entscheidender Bedeutung sind und an Entzündungen und programmiertem Zelltod beteiligt sind [46].Caspase-1 wird durch kanonische Inflammasomen aktiviert [47], während die Caspasen 4, -5 und -11 während der Bildung atypischer Inflammasomen gespalten werden [48].In dieser Studie verwendeten wir Peritonealmakrophagen von Mäusen als Modell und untersuchten p20-Caspase-1-gespaltene Caspase-1 als Marker für die NLRP3-Entzündungsaktivierung des Wirts in Studien zur G. duodenalis-Infektion.Die Ergebnisse zeigten, dass viele Alpha-Giardine für die typische Aktivierung von Entzündungen verantwortlich sind, was mit der Entdeckung wichtiger Virulenzmoleküle in Bakterien und Viren übereinstimmt.Unsere Studie ist jedoch nur ein vorläufiges Screening und es gibt andere Moleküle, die nicht-klassische Inflammasomen aktivieren können, da unsere vorherige Studie sowohl klassische als auch nicht-klassische Inflammasomen bei einer G. duodenalis-Infektion gefunden hat [13].Um weiter zu bestimmen, ob die erzeugte p20-Caspase-1 mit dem NLRP3-Inflammasom assoziiert ist, haben wir Alpha-2- und Alpha-7.3-Giardine in Peritonealmakrophagen der Maus transfiziert, um die Proteinexpressionsniveaus der Schlüsselmoleküle und die ASC-Oligomerisierungsniveaus zu bestimmen und so zu bestätigen, dass beide α-Giardine aktiviert werden Inflammasom NLRP3.Unsere Ergebnisse unterscheiden sich geringfügig von denen von Manko-Prykhoda et al., die berichteten, dass die Stimulation von Caco-2-Zellen mit G. muris- oder E. coli-EPEC-Stämmen allein die Fluoreszenzintensität von NLRP3, ASC und Caspase-1 erhöhen kann. wenn auch nicht signifikant, während die Kostimulation von G. muris und E. coli die Spiegel von drei Proteinen erhöhte [49].Diese Diskrepanz kann auf Unterschiede in der Auswahl der Giardia-Arten, Zelllinien und Primärzellen zurückzuführen sein.Wir haben auch In-vivo-Tests mit MCC950 an 5 Wochen alten weiblichen WT C57BL/6-Mäusen durchgeführt, die anfälliger für G. duodenalis sind.MCC950 ist ein wirksamer und selektiver niedermolekularer NLRP3-Inhibitor, der die kanonische und nichtkanonische NLRP3-Aktivierung bei nanomolaren Konzentrationen blockiert.MCC950 hemmt die Aktivierung von NLRP3, beeinflusst jedoch nicht die Aktivierung der Entzündungswege AIM2, NLRC4 und NLRP1 oder der TLR-Signalwege [27].MCC950 blockiert die NLRP3-Aktivierung, hemmt jedoch nicht die NLRP3-Initiierung, den K+-Ausfluss, den Ca2+-Einstrom oder die Interaktion zwischen NLRP3 und ASC;Stattdessen hemmt es die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms, indem es die ASC-Oligomerisierung blockiert [27].Daher verwendeten wir MCC950 in einer In-vivo-Studie, um die Rolle des NLRP3-Inflammasoms nach der Giardine-Injektion zu bestimmen.Aktivierte Caspase-1 p10 spaltet die proinflammatorischen Zytokine Pro-IL-1β und Pro-IL-18 in reifes IL-1β und IL-18 [50].In dieser Studie wurden Serum-IL-1β-Spiegel bei mit Giardine behandelten Mäusen mit oder ohne MCC950 als Indikator dafür verwendet, ob das NLRP3-Inflammasom aktiviert war.Wie erwartet reduzierte die Behandlung mit MCC950 die Serum-IL-1β-Spiegel signifikant.Diese Daten zeigen deutlich, dass G. duodenalis Giardin alfa-2 und Giardin alfa-7.3 in der Lage sind, das NLRP3-Maus-Inflammasom zu aktivieren.
Wichtige Daten, die im letzten Jahrzehnt gesammelt wurden, haben gezeigt, dass IL-17A der Hauptregulator der Immunität gegen G. muris ist, der die IL-17RA-Signalübertragung induziert, antimikrobielle Peptide produziert und die Komplementaktivierung reguliert [51].Eine Giardia-Infektion tritt jedoch häufiger bei jungen Erwachsenen auf, und es wurde berichtet, dass eine Giardia-Infektion bei jungen Mäusen die IL-17A-Reaktion nicht aktiviert, um ihre schützende Wirkung auszuüben [52], was Forscher dazu veranlasste, nach anderen immunmodulatorischen Giardien zu suchen.Mechanismen der Helmintheninfektion.Die Autoren einer aktuellen Studie berichteten, dass G. muris das NLRP3-Inflammasom durch E. coli EPEC aktivieren kann, was die Produktion antimikrobieller Peptide fördert und dessen Bindungskapazität sowie die Anzahl der Trophozoiten im Darmtrakt verringert, wodurch die Schwere des Dickdarms verringert wird durch Bazillen verursachte Krankheiten [49 ].Das NLRP3-Inflammasom ist an der Entstehung verschiedener Krankheiten beteiligt.Studien haben gezeigt, dass Pseudomonas aeruginosa die Autophagie in Makrophagen auslöst, um den Zelltod zu verhindern, und dieser Prozess hängt von der Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms ab [53].Bei N. caninum begrenzt die durch reaktive Sauerstoffspezies vermittelte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms dessen Replikation im Wirt und macht es zu einem potenziellen therapeutischen Ziel [9].Es wurde festgestellt, dass Paracoccidioides brasiliensis die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in aus dem Knochenmark der Maus stammenden dendritischen Zellen induziert, was zur Freisetzung des entzündlichen Zytokins IL-1β führt, das eine entscheidende Rolle bei der Wirtsabwehr spielt [10].Mehrere Leishmania-Arten, darunter L. amazonensis, L. major, L. braziliensis und L. infantum chagasi, aktivieren NLRP3 und ASC-abhängige Caspase-1 in Makrophagen sowie eine Leishmania-Infektion.Die Parasitenreplikation ist bei Mäusen verstärkt, denen das NLRP3/ASC/Caspase-1-Gen fehlt [11].Zamboni et al.Es wurde berichtet, dass eine Leishmania-Infektion die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in Makrophagen induziert, was die intrazelluläre Parasitenreplikation einschränkt.Daher kann Leishmania als Vermeidungsstrategie die Aktivierung von NLRP3 hemmen.In In-vivo-Studien trug das NLRP3-Inflammasom zur Eliminierung von Leishmania bei, hatte jedoch keine Auswirkungen auf das Gewebe [54].Umgekehrt unterdrückte in Helminthiasis-Studien die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms die schützende Immunität des Wirts gegen gastrointestinale Helminthiasis [12].Shigella ist weltweit einer der Hauptverursacher von Durchfallerkrankungen.Diese Bakterien können die IL-1β-Produktion durch P2X7-Rezeptor-vermittelten K+-Ausfluss, reaktive Sauerstoffspezies, lysosomale Versauerung und mitochondriale Schädigung induzieren.Das NLRP3-Inflammasom reguliert negativ die Phagozytose und die bakterizide Aktivität von Makrophagen gegen Shigellen [55].Plasmodium-Studien haben gezeigt, dass mit Plasmodium infizierte Mäuse mit AIM2-, NLRP3- oder Caspase-1-Mangel hohe Mengen an Typ-1-Interferon produzieren und resistenter gegen eine Plasmodium-Infektion sind [56].Die Rolle von Alpha-2-Giardin und Alpha-7.3-Giardin bei der Auslösung der pathogenen Aktivierung der NLRP3-Entzündung bei Mäusen ist jedoch unklar.
In dieser Studie reduzierte die Hemmung des NLRP3-Inflammasoms durch MCC950 das BW und erhöhte die Anzahl der Trophozoiten in der Darmspülflüssigkeit bei Mäusen, was zu schwerwiegenderen pathologischen Veränderungen im Zwölffingerdarmgewebe führte.Alpha-2-Giardine und Alpha-7.3-Giardine aktivieren das NLRP3-Inflammasom der Wirtsmaus, erhöhen das Körpergewicht der Maus, verringern die Anzahl der Trophozoiten in der Darmspülflüssigkeit und lindern pathologische Zwölffingerdarmläsionen.Diese Ergebnisse legen nahe, dass G. duodenalis das NLRP3-Wirtsinflammasom über Alpha-2-Giardine und Alpha-7,3-Giardine aktivieren kann, wodurch die Pathogenität von G. duodenalis bei Mäusen verringert wird.
Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass Alpha-2- und Alpha-7.3-Giardine die Aktivierung des NLRP3-Wirts-Inflammasoms induzieren und die Infektiosität von G. duodenalis bei Mäusen verringern.Daher sind diese Moleküle vielversprechende Ziele für die Prävention von Giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: ein Überblick.Kürzlich wurde bekannt, dass Pat Inflamm allergisch auf Medikamente reagiert.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: eine Überprüfung der Pharmakotherapie.Gutachten eines Apothekers.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, Arzneimittelresistenz und die Entdeckung neuer Angriffspunkte.Infiziert Ziele von Disord-Medikamenten.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T usw. NLRP3-Inflammasom und entzündliche Erkrankungen.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Die Rolle des Inflammasoms bei Darmentzündungen und Krebs.Gastroenterologie.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonische und atypische NLRP3-Inflammasom-Aktivierung an der Schnittstelle von Immuntoleranz und Darmentzündung.präimmun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Die ROS-vermittelte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms ist an der Reaktion auf eine Infektion mit N. caninum beteiligt.Parasitenvektor.2020;13:449.