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Genvektoren zur Behandlung von pulmonaler Mukoviszidose müssen gezielt auf die leitfähigen Atemwege ausgerichtet sein, da die periphere Lungentransduktion keinen therapeutischen Effekt hat.Die Effizienz der Virustransduktion steht in direktem Zusammenhang mit der Verweilzeit des Trägers.Allerdings diffundieren Abgabeflüssigkeiten wie Genträger auf natürliche Weise während der Inhalation in die Alveolen, und therapeutische Partikel jeglicher Form werden durch mukoziliären Transport schnell entfernt.Die Verweildauer von Genträgern im Atemtrakt zu verlängern ist wichtig, aber schwer zu erreichen.Trägerkonjugierte magnetische Partikel, die auf die Oberfläche der Atemwege gerichtet werden können, können die regionale Ausrichtung verbessern.Aufgrund von Problemen bei der In-vivo-Bildgebung ist das Verhalten solch kleiner Magnetpartikel auf der Atemwegsoberfläche in Gegenwart eines angelegten Magnetfelds nur unzureichend verstanden.Das Ziel dieser Studie war es, mithilfe der Synchrotron-Bildgebung die Bewegung einer Reihe magnetischer Partikel in der Luftröhre anästhesierter Ratten in vivo zu visualisieren, um die Dynamik und Verhaltensmuster einzelner und großer Partikel in vivo zu untersuchen.Anschließend untersuchten wir auch, ob die Verabreichung lentiviraler Magnetpartikel in Gegenwart eines Magnetfelds die Effizienz der Transduktion in der Luftröhre der Ratte erhöhen würde.Synchrotron-Röntgenbildgebung zeigt das Verhalten magnetischer Partikel in stationären und bewegten Magnetfeldern in vitro und in vivo.Mithilfe von Magneten können Partikel nicht einfach über die Oberfläche lebender Atemwege gezogen werden, aber während des Transports konzentrieren sich die Ablagerungen im Sichtfeld, wo das Magnetfeld am stärksten ist.Die Transduktionseffizienz wurde auch um das Sechsfache erhöht, wenn lentivirale Magnetpartikel in Gegenwart eines Magnetfelds abgegeben wurden.Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass lentivirale Magnetpartikel und Magnetfelder wertvolle Ansätze zur Verbesserung des Genvektor-Targetings und der Transduktionsniveaus in den leitfähigen Atemwegen in vivo sein könnten.
Zystische Fibrose (CF) wird durch Variationen in einem einzelnen Gen namens CF-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR) verursacht.Das CFTR-Protein ist ein Ionenkanal, der in vielen Epithelzellen im ganzen Körper vorhanden ist, einschließlich der Atemwege, einem wichtigen Ort bei der Pathogenese von Mukoviszidose.Defekte in der CFTR führen zu einem abnormalen Wassertransport, einer Dehydrierung der Atemwegsoberfläche und einer verringerten Tiefe der Atemwegsoberflächenflüssigkeit (ASL).Es beeinträchtigt auch die Fähigkeit des mukoziliären Transportsystems (MCT), die Atemwege von inhalierten Partikeln und Krankheitserregern zu befreien.Unser Ziel ist es, eine lentivirale (LV) Gentherapie zu entwickeln, um die korrekte Kopie des CFTR-Gens zu liefern und ASL, MCT und die Lungengesundheit zu verbessern, und weiterhin neue Technologien zu entwickeln, die diese Parameter in vivo messen können1.
LV-Vektoren sind einer der führenden Kandidaten für die Gentherapie bei Mukoviszidose, vor allem weil sie das therapeutische Gen dauerhaft in Atemwegsbasalzellen (Atemwegsstammzellen) integrieren können.Dies ist wichtig, da sie die normale Flüssigkeitszufuhr und Schleimbeseitigung wiederherstellen können, indem sie sich in funktionelle genkorrigierte Oberflächenzellen der Atemwege differenzieren, die mit Mukoviszidose assoziiert sind, was zu lebenslangen Vorteilen führt.LV-Vektoren müssen gegen die leitfähigen Atemwege gerichtet sein, da hier die Lungenbeteiligung bei CF beginnt.Die Zufuhr des Vektors tiefer in die Lunge kann zu einer alveolären Transduktion führen, diese hat jedoch keine therapeutische Wirkung bei Mukoviszidose.Allerdings wandern Flüssigkeiten wie Genträger auf natürliche Weise in die Alveolen, wenn sie nach der Geburt eingeatmet werden3,4 und therapeutische Partikel werden durch MCTs schnell in die Mundhöhle ausgestoßen.Die Effizienz der LV-Transduktion hängt direkt davon ab, wie lange der Vektor in der Nähe der Zielzellen bleibt, um die Zellaufnahme zu ermöglichen – „Verweilzeit“ 5, die durch den typischen regionalen Luftstrom sowie die koordinierte Aufnahme von Schleim und MCT-Partikeln leicht verkürzt werden kann.Bei Mukoviszidose ist die Fähigkeit, die LV-Verweilzeit in den Atemwegen zu verlängern, wichtig, um in diesem Bereich ein hohes Maß an Transduktion zu erreichen, stellte jedoch bislang eine Herausforderung dar.
Um diese Hürde zu überwinden, schlagen wir vor, dass LV-Magnetpartikel (MPs) auf zwei sich ergänzende Arten helfen können.Erstens können sie von einem Magneten zur Oberfläche der Atemwege geführt werden, um die Zielgenauigkeit zu verbessern und dazu beizutragen, dass sich Genträgerpartikel im richtigen Bereich der Atemwege befinden.und ASL) wandern in die Zellschicht 6. MPs werden häufig als gezielte Arzneimittelabgabevehikel verwendet, wenn sie an Antikörper, Chemotherapeutika oder andere kleine Moleküle binden, die sich an Zellmembranen oder an ihre jeweiligen Zelloberflächenrezeptoren binden und sich an Tumorstellen ansammeln Vorhandensein statischer Elektrizität.Magnetfelder zur Krebstherapie 7. Andere „hyperthermische“ Methoden zielen darauf ab, Tumorzellen abzutöten, indem MPs erhitzt werden, wenn sie oszillierenden Magnetfeldern ausgesetzt werden.Das Prinzip der magnetischen Transfektion, bei der ein Magnetfeld als Transfektionsmittel verwendet wird, um den Transfer von DNA in Zellen zu verbessern, wird häufig in vitro unter Verwendung einer Reihe nicht-viraler und viraler Genvektoren für schwer zu transduzierende Zelllinien verwendet ..Die Effizienz der LV-Magnetotransfektion mit der Abgabe von LV MP in vitro an eine Zelllinie aus menschlichem Bronchialepithel in Gegenwart eines statischen Magnetfelds wurde nachgewiesen, wodurch die Effizienz der Transduktion im Vergleich zum LV-Vektor allein um das 186-fache gesteigert wurde.LV MT wurde auch auf ein In-vitro-Modell der Mukoviszidose angewendet, bei dem die magnetische Transfektion die LV-Transduktion in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen in Gegenwart von Mukoviszidose-Sputum um den Faktor 20 steigerte10.Allerdings hat die In-vivo-Organmagnetotransfektion relativ wenig Beachtung gefunden und wurde nur in wenigen Tierstudien untersucht11,12,13,14,15, insbesondere in der Lunge16,17.Die Möglichkeiten der magnetischen Transfektion in der Lungentherapie bei Mukoviszidose sind jedoch klar.Tan et al.(2020) gaben an, dass „eine Validierungsstudie zur wirksamen pulmonalen Verabreichung magnetischer Nanopartikel den Weg für zukünftige CFTR-Inhalationsstrategien ebnen wird, um die klinischen Ergebnisse bei Patienten mit Mukoviszidose zu verbessern“6.
Das Verhalten kleiner magnetischer Partikel auf der Oberfläche der Atemwege in Gegenwart eines angelegten Magnetfelds lässt sich nur schwer visualisieren und untersuchen und ist daher kaum verstanden.In anderen Studien haben wir eine Synchrotron-Propagations-basierte Phasenkontrast-Röntgenbildgebungsmethode (PB-PCXI) zur nicht-invasiven Bildgebung und Quantifizierung winziger In-vivo-Änderungen der ASL18-Tiefe und des MCT19-Verhaltens20 entwickelt, um die Hydratation der Gaskanaloberfläche direkt zu messen und wird als Frühindikator für die Wirksamkeit einer Behandlung verwendet.Darüber hinaus verwendet unsere MCT-Bewertungsmethode Partikel mit einem Durchmesser von 10–35 µm aus Aluminiumoxid oder Glas mit hohem Brechungsindex als MCT-Marker, die mit PB-PCXI21 sichtbar sind.Beide Methoden eignen sich zur Abbildung einer Reihe von Partikeltypen, einschließlich MPs.
Aufgrund der hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung eignen sich unsere PB-PCXI-basierten ASL- und MCT-Assays gut zur Untersuchung der Dynamik und Verhaltensmuster einzelner und großer Partikel in vivo, um uns dabei zu helfen, die MP-Genabgabemethoden zu verstehen und zu optimieren.Der hier verwendete Ansatz basiert auf unseren Studien mit der SPring-8 BL20B2-Beamline, bei der wir die Flüssigkeitsbewegung nach der Verabreichung einer Dosis eines Dummy-Vektors in die Nasen- und Lungenluftwege von Mäusen visualisiert haben, um die beobachteten heterogenen Genexpressionsmuster zu erklären in unserem Gen.Tierversuche mit einer Trägerdosis von 3,4.
Ziel dieser Studie war es, mit dem PB-PCXI-Synchrotron die In-vivo-Bewegungen einer Reihe von MPs in der Luftröhre lebender Ratten zu visualisieren.Diese PB-PCXI-Bildgebungsstudien wurden entwickelt, um die MP-Serie, die Magnetfeldstärke und den Standort zu testen, um deren Auswirkung auf die MP-Bewegung zu bestimmen.Wir gingen davon aus, dass ein externes Magnetfeld dazu beitragen würde, dass der abgegebene MF im Zielgebiet bleibt oder sich dorthin bewegt.Diese Studien ermöglichten es uns auch, Magnetkonfigurationen zu bestimmen, die die Menge der nach der Ablagerung in der Luftröhre verbleibenden Partikel maximieren.In einer zweiten Reihe von Studien wollten wir diese optimale Konfiguration verwenden, um das Transduktionsmuster zu demonstrieren, das sich aus der In-vivo-Zufuhr von LV-MPs in die Atemwege von Ratten ergibt, unter der Annahme, dass die Zufuhr von LV-MPs im Zusammenhang mit der gezielten Ausrichtung auf die Atemwege resultieren würde zu einer erhöhten LV-Transduktionseffizienz..
Alle Tierversuche wurden gemäß den von der University of Adelaide (M-2019-060 und M-2020-022) und dem SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee genehmigten Protokollen durchgeführt.Die Experimente wurden gemäß den Empfehlungen von ARRIVE durchgeführt.
Alle Röntgenbilder wurden an der BL20XU-Beamline am SPring-8-Synchrotron in Japan mit einem Aufbau aufgenommen, der dem zuvor beschriebenen ähnelt21,22.Kurz gesagt, die Experimentierbox befand sich 245 m vom Synchrotron-Speicherring entfernt.Für Partikelbildgebungsstudien wird ein Proben-Detektor-Abstand von 0,6 m und für In-vivo-Bildgebungsstudien ein Abstand von 0,3 m verwendet, um Phasenkontrasteffekte zu erzeugen.Es wurde ein monochromatischer Strahl mit einer Energie von 25 keV verwendet.Die Bilder wurden mit einem hochauflösenden Röntgenwandler (SPring-8 BM3) aufgenommen, der an einen sCMOS-Detektor gekoppelt war.Der Wandler wandelt Röntgenstrahlen mithilfe eines 10 µm dicken Szintillators (Gd3Al2Ga3O12) in sichtbares Licht um, das dann mithilfe eines ×10-Mikroskopobjektivs (NA 0,3) zum sCMOS-Sensor geleitet wird.Der sCMOS-Detektor war ein Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mit einer Arraygröße von 2048 × 2048 Pixeln und einer Rohpixelgröße von 6,5 × 6,5 µm.Diese Einstellung ergibt eine effektive isotrope Pixelgröße von 0,51 µm und ein Sichtfeld von etwa 1,1 mm × 1,1 mm.Die Expositionsdauer von 100 ms wurde gewählt, um das Signal-Rausch-Verhältnis magnetischer Partikel innerhalb und außerhalb der Atemwege zu maximieren und gleichzeitig durch die Atmung verursachte Bewegungsartefakte zu minimieren.Für In-vivo-Studien wurde ein schneller Röntgenverschluss in den Röntgenstrahlengang eingebaut, um die Strahlendosis zu begrenzen, indem der Röntgenstrahl zwischen den Belichtungen blockiert wird.
LV-Medien wurden in keiner SPring-8 PB-PCXI-Bildgebungsstudie verwendet, da die BL20XU-Bildgebungskammer nicht für Biosicherheitsstufe 2 zertifiziert ist.Stattdessen haben wir eine Reihe gut charakterisierter MPs von zwei kommerziellen Anbietern ausgewählt, die eine Reihe von Größen, Materialien, Eisenkonzentrationen und Anwendungen abdecken – zunächst, um zu verstehen, wie Magnetfelder die Bewegung von MPs in Glaskapillaren beeinflussen, und dann in lebende Atemwege.Oberfläche.Die Größe des MP variiert zwischen 0,25 und 18 µm und besteht aus verschiedenen Materialien (siehe Tabelle 1), aber die Zusammensetzung jeder Probe, einschließlich der Größe der magnetischen Partikel im MP, ist unbekannt.Basierend auf unseren umfangreichen MCT-Studien 19, 20, 21, 23, 24 gehen wir davon aus, dass MPs bis zu 5 µm auf der Oberfläche der trachealen Atemwege sichtbar sind, indem wir beispielsweise aufeinanderfolgende Bilder subtrahieren, um eine bessere Sichtbarkeit der MP-Bewegung zu erhalten.Ein einzelner MP von 0,25 µm ist kleiner als die Auflösung des Bildgebungsgeräts, aber PB-PCXI soll ihren volumetrischen Kontrast und die Bewegung der Oberflächenflüssigkeit, auf der sie nach der Abscheidung abgeschieden werden, erfassen.
Beispiele für jeden MP in der Tabelle.1 wurde in 20 μl Glaskapillaren (Drummond Microcaps, PA, USA) mit einem Innendurchmesser von 0,63 mm hergestellt.Korpuskulare Partikel sind in Wasser erhältlich, während CombiMag-Partikel in der proprietären Flüssigkeit des Herstellers erhältlich sind.Jedes Röhrchen wird zur Hälfte mit Flüssigkeit gefüllt (ca. 11 µl) und auf den Probenhalter gestellt (siehe Abbildung 1).Die Glaskapillaren wurden jeweils horizontal auf dem Tisch in der Bildgebungskammer platziert und an den Rändern der Flüssigkeit positioniert.Ein Nickelschalenmagnet mit 19 mm Durchmesser (28 mm Länge) aus seltenen Erden, Neodym, Eisen und Bor (NdFeB) (N35, Kat.-Nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) mit einer Remanenz von 1,17 T wurde an einem befestigt Separater Transfertisch, um Ihre Position während des Renderns aus der Ferne zu ändern.Die Röntgenbildgebung beginnt, wenn der Magnet etwa 30 mm über der Probe positioniert ist und Bilder mit 4 Bildern pro Sekunde aufgenommen werden.Während der Bildgebung wurde der Magnet in die Nähe des Glaskapillarröhrchens gebracht (in einem Abstand von etwa 1 mm) und dann entlang des Röhrchens bewegt, um den Einfluss von Feldstärke und Position zu beurteilen.
Ein In-vitro-Bildgebungsaufbau mit MP-Proben in Glaskapillaren im Stadium der Translation der xy-Probe.Der Verlauf des Röntgenstrahls ist mit einer roten gestrichelten Linie markiert.
Nachdem die In-vitro-Sichtbarkeit von MPs festgestellt wurde, wurde eine Untergruppe von ihnen in vivo an weiblichen Wistar-Albino-Ratten vom Wildtyp (ca. 12 Wochen alt, ca. 200 g) getestet.Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), Midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) und Butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Die Ratten wurden durch intraperitoneale Injektion mit einer Pharma-Mischung (Japan) anästhesiert.Nach der Anästhesie wurden sie für die Bildgebung vorbereitet, indem das Fell um die Luftröhre entfernt, ein Endotrachealtubus (ET; 16-Ga-Intravenöskanüle, Terumo BCT) eingeführt und sie in Rückenlage auf einer speziell angefertigten Speicherfolie mit Thermobeutel immobilisiert wurden um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.22. Die Speicherfolie wurde dann in einem leichten Winkel am Probentisch in der Bildbox befestigt, um die Luftröhre horizontal auf dem Röntgenbild auszurichten, wie in Abbildung 2a gezeigt.
(a) In-vivo-Bildgebungsaufbau in der SPring-8-Bildgebungseinheit, Röntgenstrahlengang mit roter gepunkteter Linie markiert.(b,c) Die Lokalisierung des Trachealmagneten wurde aus der Ferne mithilfe von zwei orthogonal montierten IP-Kameras durchgeführt.Auf der linken Seite des Bildes auf dem Bildschirm sehen Sie die Drahtschlaufe, die den Kopf hält, und die im ET-Tubus installierte Einführkanüle.
Ein ferngesteuertes Spritzenpumpensystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mit einer 100-µl-Glasspritze wurde mit einer 30-Ga-Nadel an einen PE10-Schlauch (0,61 mm Außendurchmesser, 0,28 mm Innendurchmesser) angeschlossen.Markieren Sie den Tubus, um sicherzustellen, dass sich die Spitze beim Einführen des Endotrachealtubus in der richtigen Position in der Luftröhre befindet.Mithilfe einer Mikropumpe wurde der Spritzenkolben entfernt und die Spitze des Röhrchens in die abzugebende MP-Probe eingetaucht.Der geladene Abgabeschlauch wurde dann in den Endotrachealtubus eingeführt, wobei die Spitze an der stärksten Stelle unseres erwarteten angelegten Magnetfelds platziert wurde.Die Bildaufnahme wurde mithilfe eines Atemdetektors gesteuert, der an unsere Arduino-basierte Timing-Box angeschlossen war, und alle Signale (z. B. Temperatur, Atmung, Öffnen/Schließen des Verschlusses und Bildaufnahme) wurden mit Powerlab und LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) aufgezeichnet. 22 Bei der Bildgebung Als das Gehäuse nicht verfügbar war, wurden zwei IP-Kameras (Panasonic BB-SC382) in einem Winkel von etwa 90° zueinander positioniert und zur Kontrolle der Position des Magneten relativ zur Luftröhre während der Bildgebung verwendet (Abbildung 2b, c).Um Bewegungsartefakte zu minimieren, wurde während des terminalen Atemflussplateaus ein Bild pro Atemzug aufgenommen.
Der Magnet ist an der zweiten Stufe befestigt, die sich entfernt an der Außenseite des Abbildungskörpers befinden kann.Es wurden verschiedene Positionen und Konfigurationen des Magneten getestet, darunter: in einem Winkel von etwa 30° über der Luftröhre platziert (Konfigurationen sind in den Abbildungen 2a und 3a dargestellt);ein Magnet über dem Tier und der andere unten, wobei die Pole auf Anziehung eingestellt sind (Abbildung 3b)., ein Magnet über dem Tier und einer darunter, wobei die Pole auf Abstoßung eingestellt sind (Abbildung 3c), und ein Magnet über und senkrecht zur Luftröhre (Abbildung 3d).Nachdem Sie das Tier und den Magneten eingerichtet und das zu testende MP in die Spritzenpumpe geladen haben, geben Sie bei der Bildaufnahme eine Dosis von 50 µl mit einer Geschwindigkeit von 4 µl/s ab.Der Magnet wird dann entlang oder über die Luftröhre hin und her bewegt, während weiterhin Bilder aufgenommen werden.
Magnetkonfiguration für die In-vivo-Bildgebung (a) ein Magnet über der Luftröhre in einem Winkel von etwa 30°, (b) zwei Magnete, die für die Anziehung konfiguriert sind, (c) zwei Magnete, die für die Abstoßung konfiguriert sind, (d) ein Magnet über und senkrecht dazu Luftröhre.Der Beobachter blickte vom Mund durch die Luftröhre auf die Lunge, und der Röntgenstrahl durchdrang die linke Seite der Ratte und trat auf der rechten Seite aus.Der Magnet wird entweder entlang der Atemwege oder links und rechts über der Luftröhre in Richtung des Röntgenstrahls bewegt.
Wir wollten auch die Sichtbarkeit und das Verhalten von Partikeln in den Atemwegen bestimmen, ohne dass Atmung und Herzfrequenz vermischt werden.Daher wurden die Tiere am Ende des Bildgebungszeitraums aufgrund einer Pentobarbital-Überdosis (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip) auf humane Weise eingeschläfert.Einige Tiere wurden auf der Bildgebungsplattform belassen und nach dem Aufhören von Atmung und Herzschlag wurde der Bildgebungsprozess wiederholt, wobei eine zusätzliche Dosis MP hinzugefügt wurde, wenn kein MP auf der Atemwegsoberfläche sichtbar war.
Die resultierenden Bilder wurden hinsichtlich Flach- und Dunkelfeld korrigiert und dann mithilfe eines in MATLAB (R2020a, The Mathworks) geschriebenen benutzerdefinierten Skripts zu einem Film zusammengesetzt (20 Bilder pro Sekunde; 15–25-fache normale Geschwindigkeit, abhängig von der Atemfrequenz).
Alle Studien zur Übertragung von LV-Genvektoren wurden am Labortierforschungszentrum der Universität Adelaide durchgeführt und zielten darauf ab, die Ergebnisse des SPring-8-Experiments zu nutzen, um zu beurteilen, ob die Übertragung von LV-MP in Gegenwart eines Magnetfelds den Gentransfer in vivo verbessern könnte .Um die Auswirkungen von MF und Magnetfeld zu bewerten, wurden zwei Gruppen von Tieren behandelt: Einer Gruppe wurde LV MF mit Magnetplatzierung injiziert, und der anderen Gruppe wurde eine Kontrollgruppe mit LV MF ohne Magnet injiziert.
LV-Genvektoren wurden mit zuvor beschriebenen Methoden erzeugt 25, 26 .Der LacZ-Vektor exprimiert ein im Zellkern lokalisiertes Beta-Galactosidase-Gen, das vom konstitutiven MPSV-Promotor (LV-LacZ) gesteuert wird und in transduzierten Zellen ein blaues Reaktionsprodukt erzeugt, das auf Vorderseiten und Abschnitten des Lungengewebes sichtbar ist.Die Titration wurde in Zellkulturen durchgeführt, indem die Anzahl der LacZ-positiven Zellen manuell mit einem Hämozytometer gezählt wurde, um den Titer in TU/ml zu berechnen.Die Träger werden bei -80 °C kryokonserviert, vor der Verwendung aufgetaut und durch 1:1-Mischen und mindestens 30-minütiges Inkubieren auf Eis vor der Lieferung an CombiMag gebunden.
Normale Sprague-Dawley-Ratten (n = 3/Gruppe, ~2-3 ip mit einer Mischung aus 0,4 mg/kg Medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) und 60 mg/kg Ketamin (Ilium, Australien) im Alter von 1 Monat anästhesiert) ip ) Injektion und nicht-chirurgische orale Kanülierung mit einer 16-Ga-Intravenöskanüle.Um sicherzustellen, dass das Tracheal-Atemwegsgewebe eine LV-Transduktion erhält, wurde es unter Verwendung unseres zuvor beschriebenen mechanischen Störungsprotokolls konditioniert, bei dem die Tracheal-Atemwegsoberfläche axial mit einem Drahtkorb (N-Circle, Nitinol-Steinextraktor ohne Spitze NTSE-022115) -UDH gerieben wurde. Cook Medical, USA) 30 S. 28.Dann, etwa 10 Minuten nach der Störung in der Biosicherheitswerkbank, wurde die tracheale Verabreichung von LV-MP durchgeführt.
Das in diesem Experiment verwendete Magnetfeld wurde ähnlich wie bei einer In-vivo-Röntgenuntersuchung konfiguriert, wobei dieselben Magnete mit Destillationsstentklemmen über der Luftröhre gehalten wurden (Abbildung 4).Ein 50-µl-Volumen (2 x 25-µl-Aliquots) LV-MP wurde mit einer Pipette mit Gelspitze wie zuvor beschrieben in die Luftröhre (n = 3 Tiere) abgegeben.Die Kontrollgruppe (n = 3 Tiere) erhielt das gleiche LV-MP ohne Verwendung eines Magneten.Nach Abschluss der Infusion wird die Kanüle aus dem Endotrachealtubus entfernt und das Tier extubiert.Der Magnet bleibt 10 Minuten lang an Ort und Stelle, bevor er entfernt wird.Den Ratten wurde subkutan Meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australien) verabreicht, gefolgt von einer Narkoseentwöhnung durch intraperitoneale Injektion von 1 mg/kg Atipamazolhydrochlorid (Antisedan, Zoetis, Australien).Die Ratten wurden warm gehalten und beobachtet, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hatten.
LV-MP-Abgabegerät in einer biologischen Sicherheitswerkbank.Sie können sehen, dass die hellgraue Luer-Lock-Hülse des ET-Schlauchs aus dem Mund herausragt und die in der Abbildung gezeigte Gelpipettenspitze durch den ET-Schlauch bis zur gewünschten Tiefe in die Luftröhre eingeführt wird.
Eine Woche nach der LV-MP-Verabreichung wurden die Tiere durch Inhalation von 100 % CO2 auf humane Weise getötet und die LacZ-Expression wurde unter Verwendung unserer Standard-X-Gal-Behandlung beurteilt.Die drei am weitesten kaudal gelegenen Knorpelringe wurden entfernt, um sicherzustellen, dass mechanische Schäden oder Flüssigkeitsansammlungen aufgrund der Platzierung des Endotrachealtubus nicht in die Analyse einbezogen werden.Jede Luftröhre wurde der Länge nach aufgeschnitten, um zwei Hälften für die Analyse zu erhalten, und mit einer Minutien-Nadel (Fine Science Tools) in einen Becher mit Silikonkautschuk (Sylgard, Dow Inc.) gegeben, um die Lumenoberfläche sichtbar zu machen.Die Verteilung und der Charakter der transduzierten Zellen wurden durch Frontalfotografie unter Verwendung eines Nikon-Mikroskops (SMZ1500) mit einer DigiLite-Kamera und TCapture-Software (Tucsen Photonics, China) bestätigt.Die Bilder wurden mit 20-facher Vergrößerung (einschließlich der maximalen Einstellung für die gesamte Breite der Luftröhre) aufgenommen, wobei die gesamte Länge der Luftröhre Schritt für Schritt angezeigt wurde, sodass genügend Überlappung zwischen den einzelnen Bildern gewährleistet war, um ein „Zusammenfügen“ der Bilder zu ermöglichen.Die Bilder von jeder Luftröhre wurden dann mit Composite Image Editor Version 2.0.3 (Microsoft Research) unter Verwendung des Planar-Motion-Algorithmus zu einem einzigen zusammengesetzten Bild kombiniert. Der Bereich der LacZ-Expression innerhalb der Tracheal-Kompositbilder von jedem Tier wurde mithilfe eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben28 quantifiziert, wobei die Einstellungen 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Wert < 0,7 verwendet wurden. Der Bereich der LacZ-Expression innerhalb der Tracheal-Kompositbilder von jedem Tier wurde mithilfe eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben28 quantifiziert, wobei die Einstellungen 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Wert < 0,7 verwendet wurden. Die Übertragung der LacZ-Expression auf die von der Gesellschaft verwendeten Bilder wurde mit der automatischen MATLAB-Anwendung (R20) durchgeführt 20a, MathWorks), wie in Abschnitt 28 beschrieben, mit der Verwendung von 0,35 <0,58, angegeben> 0,15 und <0 ,7. Der Bereich der LacZ-Expression in zusammengesetzten Trachealbildern von jedem Tier wurde mithilfe eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben28 unter Verwendung von Einstellungen von 0,35 quantifiziert0,15 und Wert<0,7.Die neueste Version von MATLAB (R2020a, MathWorks) und die neueste Version von LacZ Gewicht: 0,35 < 0,58, 0,15 < 0,7 Prozent.如 前所 述, 自动 自动 Matlab 脚本 (（r2020a), Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的量化, 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 .................... HÜFTE Die LacZ-Ausdruckssoftware wurde mit der automatischen Automatisierungsszenarie MATLAB (R2020a, MathWorks) erstellt. Gemäß der Beschreibung wurde ein Wert von 0,35 <0,58, 0,15 und <0,7 angegeben . Bereiche der LacZ-Expression auf zusammengesetzten Bildern der Luftröhre jedes Tieres wurden mithilfe eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben unter Verwendung der Einstellungen 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Wert < 0,7 quantifiziert.Durch die Verfolgung von Gewebekonturen in GIMP v2.10.24 wurde für jedes zusammengesetzte Bild manuell eine Maske erstellt, um den Gewebebereich zu identifizieren und Fehlerkennungen außerhalb des Trachealgewebes zu verhindern.Die gefärbten Bereiche aller zusammengesetzten Bilder von jedem Tier wurden summiert, um den gesamten gefärbten Bereich für dieses Tier zu ergeben.Anschließend wurde die bemalte Fläche durch die Gesamtfläche der Maske dividiert, um eine normalisierte Fläche zu erhalten.
Jede Luftröhre wurde in Paraffin eingebettet und 5 µm dick geschnitten.Die Schnitte wurden 5 Minuten lang mit neutralem Echtrot gegengefärbt und die Bilder wurden mit einem Nikon Eclipse E400-Mikroskop, einer DS-Fi3-Kamera und der NIS-Element-Capture-Software (Version 5.20.00) aufgenommen.
Alle statistischen Analysen wurden in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) durchgeführt.Die statistische Signifikanz wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt.Die Normalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test getestet und Unterschiede in der LacZ-Färbung wurden mit einem ungepaarten t-Test bewertet.
Die sechs in Tabelle 1 beschriebenen MPs wurden mit PCXI untersucht, und die Sichtbarkeit ist in Tabelle 2 beschrieben. Zwei Polystyrol-MPs (MP1 und MP2; 18 µm bzw. 0,25 µm) waren mit PCXI nicht sichtbar, die übrigen Proben konnten jedoch identifiziert werden (Beispiele sind in Abbildung 5 dargestellt).MP3 und MP4 sind schwach sichtbar (10–15 % Fe3O4; 0,25 µm bzw. 0,9 µm).Obwohl MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) einige der kleinsten getesteten Partikel enthielt, war es am ausgeprägtesten.Das Produkt CombiMag MP6 ist schwer zu unterscheiden.In allen Fällen wurde unsere Fähigkeit, MFs zu erkennen, erheblich verbessert, indem wir den Magneten parallel zur Kapillare hin und her bewegten.Als sich die Magnete von der Kapillare entfernten, wurden die Partikel in langen Ketten herausgezogen, aber als sich die Magnete näherten und die Magnetfeldstärke zunahm, verkürzten sich die Partikelketten, während die Partikel zur oberen Oberfläche der Kapillare wanderten (siehe Zusatzvideo S1). : MP4), wodurch die Partikeldichte an der Oberfläche erhöht wird.Wenn umgekehrt der Magnet aus der Kapillare entfernt wird, nimmt die Feldstärke ab und die MPs ordnen sich in langen Ketten neu an, die sich von der oberen Oberfläche der Kapillare erstrecken (siehe Zusatzvideo S2: MP4).Nachdem der Magnet aufgehört hat, sich zu bewegen, bewegen sich die Partikel noch einige Zeit weiter, nachdem sie die Gleichgewichtsposition erreicht haben.Während sich der MP zur oberen Oberfläche der Kapillare hin und von dieser weg bewegt, neigen die magnetischen Partikel dazu, Schmutzpartikel durch die Flüssigkeit zu ziehen.
Die Sichtbarkeit von MP unter PCXI variiert erheblich zwischen den Proben.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6.Alle hier gezeigten Bilder wurden mit einem Magneten aufgenommen, der etwa 10 mm direkt über der Kapillare positioniert war.Die scheinbar großen Kreise sind in den Kapillaren eingeschlossene Luftblasen und zeigen deutlich die schwarzen und weißen Randmerkmale des Phasenkontrastbilds.Das rote Kästchen gibt die Vergrößerung an, die den Kontrast verstärkt.Beachten Sie, dass die Durchmesser der Magnetkreise in allen Abbildungen nicht maßstabsgetreu sind und etwa 100-mal größer sind als dargestellt.
Wenn sich der Magnet entlang der Oberseite der Kapillare nach links und rechts bewegt, ändert sich der Winkel der MP-Reihe, um sich am Magneten auszurichten (siehe Abbildung 6), wodurch die magnetischen Feldlinien abgegrenzt werden.Bei MP3-5 ziehen die Partikel entlang der oberen Oberfläche der Kapillare, nachdem die Sehne den Schwellenwinkel erreicht hat.Dies führt häufig dazu, dass sich MPs in der Nähe der Stelle, an der das Magnetfeld am stärksten ist, zu größeren Gruppen zusammenschließen (siehe Zusatzvideo S3: MP5).Dies wird auch besonders deutlich, wenn die Aufnahme nahe dem Ende der Kapillare erfolgt, was dazu führt, dass sich das MP an der Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche ansammelt und konzentriert.Die Partikel im MP6, die schwerer zu unterscheiden waren als die im MP3-5, zogen nicht mit, als sich der Magnet entlang der Kapillare bewegte, sondern die MP-Stränge dissoziierten und ließen die Partikel im Sichtfeld zurück (siehe Zusatzvideo S4: MP6).In einigen Fällen, als das angelegte Magnetfeld reduziert wurde, indem der Magnet über eine weite Entfernung von der Bildgebungsstelle bewegt wurde, sanken alle verbleibenden MPs durch die Schwerkraft langsam auf die Bodenfläche des Rohrs und blieben in der Saite (siehe Zusatzvideo S5: MP3). .
Der Winkel des MP-Strangs ändert sich, wenn sich der Magnet über der Kapillare nach rechts bewegt.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6.Das rote Kästchen gibt die Vergrößerung an, die den Kontrast verstärkt.Bitte beachten Sie, dass die zusätzlichen Videos zu Informationszwecken dienen, da sie wichtige Partikelstruktur- und dynamische Informationen offenbaren, die in diesen statischen Bildern nicht visualisiert werden können.
Unsere Tests haben gezeigt, dass das langsame Vor- und Zurückbewegen des Magneten entlang der Luftröhre die Visualisierung der MF im Kontext komplexer Bewegungen in vivo erleichtert.Es wurden keine In-vivo-Tests durchgeführt, da die Polystyrolkügelchen (MP1 und MP2) in der Kapillare nicht sichtbar waren.Jeder der verbleibenden vier MFs wurde in vivo getestet, wobei die Längsachse des Magneten in einem Winkel von etwa 30° zur Vertikalen über der Luftröhre positioniert war (siehe Abbildungen 2b und 3a), da dies zu längeren MF-Ketten führte und effektiver war als ein Magnet..Konfiguration beendet.MP3, MP4 und MP6 wurden in der Luftröhre keines lebenden Tieres gefunden.Bei der Visualisierung der Atemwege von Ratten nach der humanen Tötung der Tiere blieben die Partikel unsichtbar, selbst wenn mit einer Spritzenpumpe zusätzliches Volumen hinzugefügt wurde.MP5 hatte den höchsten Eisenoxidgehalt und war das einzige sichtbare Partikel. Daher wurde es zur Bewertung und Charakterisierung des MP-Verhaltens in vivo verwendet.
Die Platzierung des Magneten über der Luftröhre während der MF-Einführung führte dazu, dass viele, aber nicht alle MFs im Sichtfeld konzentriert waren.Das Eindringen von Partikeln in die Luftröhre lässt sich am besten bei human eingeschläferten Tieren beobachten.Abbildung 7 und Zusatzvideo S6: MP5 zeigt die schnelle magnetische Erfassung und Ausrichtung von Partikeln auf der Oberfläche der ventralen Luftröhre, was darauf hinweist, dass MPs auf gewünschte Bereiche der Luftröhre gezielt werden können.Bei der Suche weiter distal entlang der Luftröhre nach der MF-Abgabe wurden einige MFs näher an der Carina gefunden, was darauf hinweist, dass die Magnetfeldstärke nicht ausreicht, um alle MFs zu sammeln und zu halten, da sie während der Flüssigkeitsverabreichung durch den Bereich der maximalen Magnetfeldstärke abgegeben wurden.Verfahren.Allerdings waren die postnatalen MP-Konzentrationen im Bildbereich höher, was darauf hindeutet, dass viele MPs in den Atemwegsregionen verblieben, in denen die angelegte Magnetfeldstärke am höchsten war.
Bilder von (a) vor und (b) nach der Abgabe von MP5 in die Luftröhre einer kürzlich eingeschläferten Ratte mit einem direkt über dem Bildgebungsbereich platzierten Magneten.Der abgebildete Bereich liegt zwischen zwei Knorpelringen.Vor der Entbindung des MP befindet sich etwas Flüssigkeit in den Atemwegen.Das rote Kästchen gibt die Vergrößerung an, die den Kontrast verstärkt.Diese Bilder stammen aus dem Video in S6: MP5-Zusatzvideo.
Das Bewegen des Magneten entlang der Luftröhre in vivo führte zu einer Änderung des Winkels der MP-Kette auf der Atemwegsoberfläche, ähnlich der in Kapillaren beobachteten (siehe Abbildung 8 und Zusatzvideo S7: MP5).In unserer Studie konnten MPs jedoch nicht wie Kapillaren über die Oberfläche lebender Atemwege gezogen werden.In manchen Fällen verlängert sich die MP-Kette, wenn sich der Magnet nach links und rechts bewegt.Interessanterweise haben wir auch herausgefunden, dass die Partikelkette die Tiefe der Oberflächenschicht der Flüssigkeit verändert, wenn der Magnet in Längsrichtung entlang der Luftröhre bewegt wird, und sich ausdehnt, wenn der Magnet direkt über den Kopf bewegt und die Partikelkette in eine vertikale Position gedreht wird (siehe Ergänzungsvideo S7).: MP5 bei 0:09, unten rechts).Das charakteristische Bewegungsmuster änderte sich, wenn der Magnet seitlich über die Oberseite der Luftröhre bewegt wurde (dh nach links oder rechts vom Tier und nicht entlang der Länge der Luftröhre).Die Partikel waren während ihrer Bewegung noch deutlich sichtbar, aber als der Magnet aus der Luftröhre entfernt wurde, wurden die Spitzen der Partikelketten sichtbar (siehe Zusatzvideo S8: MP5, ab 0:08).Dies stimmt mit dem beobachteten Verhalten des Magnetfelds unter Einwirkung eines angelegten Magnetfelds in einer Glaskapillare überein.
Beispielbilder, die MP5 in der Luftröhre einer lebenden, anästhesierten Ratte zeigen.(a) Der Magnet wird verwendet, um Bilder oberhalb und links der Luftröhre aufzunehmen, dann (b) nachdem der Magnet nach rechts bewegt wurde.Das rote Kästchen gibt die Vergrößerung an, die den Kontrast verstärkt.Diese Bilder stammen aus dem Video im S7-Zusatzvideo: MP5.
Wenn die beiden Pole in einer Nord-Süd-Ausrichtung oberhalb und unterhalb der Luftröhre gestimmt waren (d. h. anziehend; Abb. 3b), erschienen die MP-Akkorden länger und befanden sich an der Seitenwand der Luftröhre und nicht auf der dorsalen Oberfläche der Luftröhre Luftröhre (siehe Anhang).Video S9:MP5).Allerdings wurden nach der Flüssigkeitsverabreichung mit einem Dual-Magnet-Gerät keine hohen Partikelkonzentrationen an einer Stelle (d. h. der dorsalen Oberfläche der Luftröhre) festgestellt, was normalerweise bei einem Einzel-Magnet-Gerät der Fall ist.Wenn dann ein Magnet so konfiguriert war, dass er entgegengesetzte Pole abstößt (Abbildung 3c), erhöhte sich die Anzahl der im Sichtfeld sichtbaren Partikel nach der Abgabe nicht.Die Einrichtung beider Magnetkonfigurationen ist aufgrund der hohen Magnetfeldstärke, die die Magnete anzieht bzw. drückt, eine Herausforderung.Der Aufbau wurde dann auf einen einzelnen Magneten geändert, der parallel zu den Atemwegen verläuft, aber in einem 90-Grad-Winkel durch die Atemwege verläuft, sodass die Kraftlinien die Trachealwand orthogonal kreuzen (Abbildung 3d), eine Ausrichtung, die die Möglichkeit einer Partikelaggregation bestimmen soll der Seitenwand.untersucht werden.Allerdings gab es in dieser Konfiguration keine erkennbare MF-Akkumulationsbewegung oder Magnetbewegung.Basierend auf all diesen Ergebnissen wurde eine Konfiguration mit einem einzelnen Magneten und einer 30-Grad-Ausrichtung für In-vivo-Studien an Genträgern ausgewählt (Abb. 3a).
Als das Tier unmittelbar nach der menschlichen Tötung mehrere Male fotografiert wurde, konnten aufgrund der fehlenden störenden Gewebebewegung feinere, kürzere Partikellinien im klaren interknorpeligen Feld erkannt werden, die entsprechend der Translationsbewegung des Magneten „schwankten“.deutlich das Vorhandensein und die Bewegung von MP6-Partikeln erkennen.
Der LV-LacZ-Titer betrug 1,8 x 108 IU/ml, und nach 1:1-Mischung mit CombiMag MP (MP6) wurden den Tieren 50 µl einer trachealen Dosis von 9 x 107 IU/ml LV-Vehikel (d. h. 4,5) injiziert x 106 TU/Ratte).).).In diesen Studien haben wir den Magneten während der Wehen nicht bewegt, sondern in einer Position fixiert, um festzustellen, ob die LV-Transduktion (a) im Vergleich zur Vektorabgabe ohne Magnetfeld verbessert werden könnte und (b) ob die Atemwege dies könnten sei konzentriert.Die Zellen werden in den magnetischen Zielbereichen der oberen Atemwege transduziert.
Das Vorhandensein von Magneten und die Verwendung von CombiMag in Kombination mit LV-Vektoren schien die Tiergesundheit nicht zu beeinträchtigen, ebenso wie unser Standardprotokoll zur Abgabe von LV-Vektoren.Frontalbilder der Trachealregion, die einer mechanischen Störung ausgesetzt war (ergänzende Abbildung 1), zeigten, dass die mit LV-MP behandelte Gruppe in Gegenwart eines Magneten signifikant höhere Transduktionsniveaus aufwies (Abb. 9a).In der Kontrollgruppe war nur eine geringe Menge an blauer LacZ-Färbung vorhanden (Abbildung 9b).Die Quantifizierung der mit X-Gal gefärbten normalisierten Regionen zeigte, dass die Verabreichung von LV-MP in Gegenwart eines Magnetfelds zu einer etwa sechsfachen Verbesserung führte (Abb. 9c).
Beispiel für zusammengesetzte Bilder, die die tracheale Transduktion mit LV-MP (a) in Gegenwart eines Magnetfelds und (b) in Abwesenheit eines Magneten zeigen.(c) Statistisch signifikante Verbesserung des normalisierten Bereichs der LacZ-Transduktion in der Luftröhre durch die Verwendung eines Magneten (*p = 0,029, t-Test, n = 3 pro Gruppe, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts).
Neutrale, schnellrot gefärbte Schnitte (Beispiel in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt) zeigten, dass LacZ-gefärbte Zellen in derselben Probe und an derselben Stelle vorhanden waren, wie zuvor berichtet.
Die größte Herausforderung bei der Atemwegs-Gentherapie bleibt die präzise Lokalisierung von Trägerpartikeln in interessierenden Bereichen und das Erreichen einer hohen Transduktionseffizienz in der mobilen Lunge bei vorhandenem Luftstrom und aktiver Schleimbeseitigung.Für LV-Träger, die zur Behandlung von Atemwegserkrankungen bei Mukoviszidose vorgesehen sind, war die Erhöhung der Verweilzeit der Trägerpartikel in den leitfähigen Atemwegen bisher ein unerreichbares Ziel.Wie Castellani et al. betonten, hat der Einsatz von Magnetfeldern zur Verbesserung der Transduktion Vorteile gegenüber anderen Genabgabemethoden wie der Elektroporation, da er Einfachheit, Wirtschaftlichkeit, lokalisierte Abgabe, erhöhte Effizienz und kürzere Inkubationszeit vereinen kann.und möglicherweise eine geringere Fahrzeugdosis10.Allerdings wurde die In-vivo-Ablagerung und das Verhalten magnetischer Partikel in den Atemwegen unter dem Einfluss externer magnetischer Kräfte nie beschrieben, und tatsächlich wurde die Fähigkeit dieser Methode, die Genexpressionsniveaus in intakten lebenden Atemwegen zu erhöhen, in vivo nicht nachgewiesen.
Unsere In-vitro-Experimente am PCXI-Synchrotron zeigten, dass alle von uns getesteten Partikel mit Ausnahme des MP-Polystyrols in dem von uns verwendeten Bildgebungsaufbau sichtbar waren.In Gegenwart eines Magnetfelds bilden Magnetfelder Fäden, deren Länge von der Art der Partikel und der Stärke des Magnetfelds (dh der Nähe und Bewegung des Magneten) abhängt.Wie in Abbildung 10 dargestellt, entstehen die von uns beobachteten Saiten, wenn jedes einzelne Teilchen magnetisiert wird und sein eigenes lokales Magnetfeld induziert.Diese getrennten Felder bewirken, dass sich andere ähnliche Partikel aufgrund lokaler Kräfte aus den lokalen Anziehungs- und Abstoßungskräften anderer Partikel sammeln und sich mit Gruppenkettenbewegungen verbinden.
Diagramm, das (a, b) Partikelketten zeigt, die sich in flüssigkeitsgefüllten Kapillaren bilden, und (c, d) eine luftgefüllte Luftröhre.Beachten Sie, dass die Kapillaren und die Luftröhre nicht maßstabsgetreu dargestellt sind.Tafel (a) enthält auch eine Beschreibung des MF, das in Ketten angeordnete Fe3O4-Partikel enthält.
Als sich der Magnet über die Kapillare bewegte, erreichte der Winkel der Partikelkette die kritische Schwelle für MP3-5 mit Fe3O4, woraufhin die Partikelkette nicht mehr in ihrer ursprünglichen Position blieb, sondern sich entlang der Oberfläche in eine neue Position bewegte.Magnet.Dieser Effekt tritt wahrscheinlich auf, weil die Oberfläche der Glaskapillare glatt genug ist, um diese Bewegung zu ermöglichen.Interessanterweise verhielt sich MP6 (CombiMag) nicht so, vielleicht weil die Partikel kleiner waren, eine andere Beschichtung oder Oberflächenladung hatten oder die proprietäre Trägerflüssigkeit ihre Bewegungsfähigkeit beeinträchtigte.Auch der Kontrast im CombiMag-Partikelbild ist schwächer, was darauf hindeutet, dass Flüssigkeit und Partikel möglicherweise die gleiche Dichte haben und sich daher nicht leicht aufeinander zu bewegen können.Partikel können auch stecken bleiben, wenn sich der Magnet zu schnell bewegt, was darauf hindeutet, dass die magnetische Feldstärke nicht immer die Reibung zwischen Partikeln in der Flüssigkeit überwinden kann, was darauf hindeutet, dass die magnetische Feldstärke und der Abstand zwischen dem Magneten und dem Zielbereich nicht stimmen sollten Überraschung.wichtig.Diese Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass Magnete zwar viele Mikropartikel einfangen können, die durch den Zielbereich fließen, es jedoch unwahrscheinlich ist, dass man sich darauf verlassen kann, dass Magnete CombiMag-Partikel entlang der Oberfläche der Luftröhre bewegen.Daher kamen wir zu dem Schluss, dass in vivo-LV-MF-Studien statische Magnetfelder verwenden sollten, um bestimmte Bereiche des Atemwegsbaums physikalisch anzusprechen.
Sobald die Partikel in den Körper gelangen, sind sie im Kontext des komplexen, sich bewegenden Gewebes des Körpers nur schwer zu identifizieren, aber ihre Erkennungsfähigkeit wurde verbessert, indem der Magnet horizontal über die Luftröhre bewegt wurde, um die MP-Stränge zu „wackeln“.Während eine Bildgebung in Echtzeit möglich ist, ist es einfacher, Partikelbewegungen zu erkennen, nachdem das Tier auf humane Weise getötet wurde.An dieser Stelle waren die MP-Konzentrationen normalerweise am höchsten, wenn der Magnet über dem Bildgebungsbereich positioniert war, obwohl einige Partikel normalerweise weiter unten in der Luftröhre gefunden wurden.Im Gegensatz zu In-vitro-Studien können Partikel nicht durch die Bewegung eines Magneten in die Luftröhre gezogen werden.Dieser Befund steht im Einklang mit der Art und Weise, wie der Schleim, der die Oberfläche der Luftröhre bedeckt, in der Regel inhalierte Partikel verarbeitet, sie im Schleim einfängt und sie anschließend durch den mukoziliären Clearance-Mechanismus beseitigt.
Wir stellten die Hypothese auf, dass die Verwendung von Magneten oberhalb und unterhalb der Luftröhre zur Anziehung (Abb. 3b) zu einem gleichmäßigeren Magnetfeld führen könnte, anstatt zu einem Magnetfeld, das an einem Punkt stark konzentriert ist, was möglicherweise zu einer gleichmäßigeren Partikelverteilung führt..Unsere vorläufige Studie konnte jedoch keine eindeutigen Beweise für diese Hypothese finden.Ebenso führte die Einstellung eines Magnetpaares auf Abstoßung (Abb. 3c) nicht dazu, dass sich mehr Partikel im Bildbereich absetzten.Diese beiden Ergebnisse zeigen, dass der Dual-Magnet-Aufbau die lokale Kontrolle der MP-Ausrichtung nicht wesentlich verbessert und dass die resultierenden starken Magnetkräfte schwer abzustimmen sind, was diesen Ansatz weniger praktisch macht.Auch die Ausrichtung des Magneten über und quer zur Luftröhre (Abbildung 3d) erhöhte die Anzahl der im abgebildeten Bereich verbleibenden Partikel nicht.Einige dieser alternativen Konfigurationen sind möglicherweise nicht erfolgreich, da sie zu einer Verringerung der magnetischen Feldstärke in der Ablagerungszone führen.Daher gilt die Einzelmagnetkonfiguration bei 30 Grad (Abb. 3a) als die einfachste und effizienteste In-vivo-Testmethode.
Die LV-MP-Studie zeigte, dass die Transduktionswerte in der Luftröhre im Vergleich zu den Kontrollen deutlich anstiegen, wenn LV-Vektoren mit CombiMag kombiniert und nach physischer Störung in Gegenwart eines Magnetfelds verabreicht wurden.Basierend auf Synchrotron-Bildgebungsstudien und LacZ-Ergebnissen schien das Magnetfeld in der Lage zu sein, das LV in der Luftröhre zu halten und die Anzahl der Vektorpartikel zu reduzieren, die sofort tief in die Lunge eindrangen.Solche Targeting-Verbesserungen können zu einer höheren Effizienz führen und gleichzeitig die abgegebenen Titer, nicht zielgerichtete Transduktion, entzündliche und immunologische Nebenwirkungen sowie die Kosten für den Gentransfer reduzieren.Wichtig ist, dass CombiMag laut Hersteller in Kombination mit anderen Gentransfermethoden verwendet werden kann, einschließlich anderer viraler Vektoren (wie AAV) und Nukleinsäuren.