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Toxoplasma gondii ist ein intrazellulärer Protozoenparasit, der die Mikroumgebung des infizierten Wirts moduliert und bekanntermaßen mit dem Auftreten von Hirntumorwachstum verbunden ist.In dieser Studie gehen wir davon aus, dass exosomale miRNA-21 aus einer Toxoplasma-Infektion das Wachstum von Hirntumoren fördert.Exosomen aus Toxoplasma-infizierten BV2-Mikroglia wurden charakterisiert und die Internalisierung von U87-Gliomzellen bestätigt.Exosomale microRNA-Expressionsprofile wurden mithilfe von Arrays aus microRNA und microRNA-21A-5p analysiert, die mit Toxoplasma gondii und Tumorsortierung assoziiert sind.Wir untersuchten auch die mRNA-Spiegel tumorassoziierter Gene in U87-Gliomzellen durch Veränderung der miR-21-Spiegel in Exosomen und die Wirkung von Exosomen auf die Proliferation menschlicher U87-Gliomzellen.In Exosomen von U87-Gliomzellen, die mit Toxoplasma gondii infiziert sind, ist die Expression von microRNA-21 erhöht und die Aktivität von Antitumorgenen (FoxO1, PTEN und PDCD4) verringert.Von BV2 abgeleitete Exosomen, die mit Toxoplasma infiziert sind, induzieren die Proliferation von U87-Gliomzellen.Exosomen induzieren das Wachstum von U87-Zellen in einem Maustumormodell.Wir vermuten, dass erhöhtes exosomales miR-21 in Toxoplasma-infizierten BV2-Mikroglia eine wichtige Rolle als Zellwachstumsförderer in U87-Gliomzellen spielen könnte, indem es Antitumorgene herunterreguliert.
Schätzungen zufolge wurden im Jahr 2018 weltweit mehr als 18,1 Millionen Fälle von fortgeschrittenem Krebs diagnostiziert, wobei jedes Jahr etwa 297.000 Tumoren des Zentralnervensystems diagnostiziert wurden (1,6 % aller Tumoren)1.Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass zu den Risikofaktoren für die Entwicklung menschlicher Hirntumoren verschiedene chemische Produkte, Familienanamnese und ionisierende Strahlung aus therapeutischen und diagnostischen Kopfgeräten gehören.Die genaue Ursache dieser bösartigen Erkrankungen ist jedoch unbekannt.Ungefähr 20 % aller Krebserkrankungen weltweit werden durch Infektionserreger verursacht, darunter Viren, Bakterien und Parasiten3,4.Infektiöse Krankheitserreger stören die genetischen Mechanismen der Wirtszelle, wie etwa die DNA-Reparatur und den Zellzyklus, und können zu chronischen Entzündungen und Schäden am Immunsystem führen5.
Infektionserreger im Zusammenhang mit Krebs beim Menschen sind die häufigsten viralen Krankheitserreger, darunter humane Papillomaviren sowie Hepatitis-B- und -C-Viren.Parasiten können auch eine potenzielle Rolle bei der Entstehung von Krebs beim Menschen spielen.Mehrere Parasitenarten, nämlich Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis und Hymenolepis nana, wurden mit verschiedenen Arten von Krebs beim Menschen in Verbindung gebracht 6,7,8.
Toxoplasma gondii ist ein intrazelluläres Protozoon, das die Mikroumgebung infizierter Wirtszellen reguliert.Es wird geschätzt, dass dieser Parasit etwa 30 % der Weltbevölkerung infiziert, wodurch die gesamte Bevölkerung gefährdet ist9,10.Toxoplasma gondii kann lebenswichtige Organe, einschließlich des Zentralnervensystems (ZNS), infizieren und insbesondere bei immungeschwächten Patienten schwere Krankheiten wie tödliche Meningitis und Enzephalitis verursachen9.Allerdings kann Toxoplasma gondii auch die Umgebung des infizierten Wirts verändern, indem es das Zellwachstum und die Immunantwort bei immunkompetenten Personen moduliert, was zur Aufrechterhaltung einer asymptomatischen chronischen Infektion führt9,11.Interessanterweise deuten einige Berichte angesichts der Korrelation zwischen der Prävalenz von T. gondii und der Inzidenz von Hirntumoren darauf hin, dass in vivo Veränderungen der Wirtsumgebung aufgrund einer chronischen T. gondii-Infektion der Mikroumgebung des Tumors ähneln.
Exosomen sind als interzelluläre Kommunikatoren bekannt, die biologische Inhalte, einschließlich Proteine ​​und Nukleinsäuren, von benachbarten Zellen liefern16,17.Exosomen können tumorbezogene biologische Prozesse wie Anti-Apoptose, Angiogenese und Metastasierung in der Tumormikroumgebung beeinflussen.Insbesondere miRNAs (miRNAs), kleine nichtkodierende RNAs mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden, sind wichtige posttranskriptionelle Genregulatoren, die mehr als 30 % der menschlichen mRNA durch den miRNA-induzierten Silencing-Komplex (miRISC) steuern.Toxoplasma gondii kann biologische Prozesse stören, indem es die miRNA-Expression in infizierten Wirten kontrolliert.Wirts-miRNAs enthalten wichtige Signale zur Regulierung biologischer Prozesse des Wirts, um die Überlebensstrategie des Parasiten zu erreichen.Daher kann die Untersuchung von Veränderungen im miRNA-Profil des Wirts bei einer Infektion mit T. gondii uns helfen, die Interaktion zwischen dem Wirt und T. gondii besser zu verstehen.Tatsächlich haben Thirugnanam et al.15 schlugen vor, dass T. gondii die Karzinogenese im Gehirn fördert, indem es seine Expression auf spezifischen miRNAs des Wirts verändert, die mit dem Tumorwachstum verbunden sind, und fanden heraus, dass T. gondii bei Versuchstieren Gliome verursachen kann.
Diese Studie konzentriert sich auf die Veränderung von exosomalem miR-21 in mit Toxoplasma BV2 infizierten Wirtsmikroglia.Wir beobachteten eine mögliche Rolle von verändertem exosomalem miR-21 beim Wachstum von U87-Gliomzellen aufgrund der Retention von FoxO1/p27 im Zellkern, das das Ziel von überexprimiertem miR-21 ist.
Von BV2 abgeleitete Exosomen wurden mittels Differentialzentrifugation gewonnen und mit verschiedenen Methoden validiert, um eine Kontamination mit Zellbestandteilen oder anderen Vesikeln zu verhindern.Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zeigte deutliche Muster zwischen aus BV2-Zellen und Exosomen extrahierten Proteinen (Abbildung 1A), und die Proben wurden auf das Vorhandensein von Alix untersucht, das durch Western-Blot von exosomalen Proteinmarkern in analysiert wurde.Alix-Markierung wurde in Exosomenproteinen gefunden, jedoch nicht in BV2-Zelllysatproteinen (Abb. 1B).Darüber hinaus wurde gereinigte RNA aus von BV2 abgeleiteten Exosomen mit einem Bioanalysator analysiert.18S- und 28S-ribosomale Untereinheiten wurden im exosomalen RNA-Migrationsmuster selten beobachtet, was auf zuverlässige Reinheit hinweist (Abbildung 1C).Schließlich zeigte die Transmissionselektronenmikroskopie, dass die beobachteten Exosomen etwa 60–150 nm groß waren und eine für die Exosomenmorphologie typische becherartige Struktur aufwiesen (Abb. 1D).
Charakterisierung von Exosomen, die aus BV2-Zellen stammen.(A) Seite Sicherheitsdatenblatt.Proteine ​​wurden aus BV2-Zellen oder von BV2 abgeleiteten Exosomen isoliert.Proteinmuster unterscheiden sich zwischen Zellen und Exosomen.(B) Western-Blot-Analyse eines exosomalen Markers (Alix).(C) Auswertung gereinigter RNA aus BV2-Zellen und BV2-abgeleiteten Exosomen unter Verwendung eines Bioanalysators.Daher wurden ribosomale 18S- und 28S-Untereinheiten in BV2-Zellen selten in exosomaler RNA gefunden.(D) Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass aus BV2-Zellen isolierte Exosomen mit 2 % Uranylacetat negativ gefärbt waren.Exosomen sind etwa 60–150 nm groß und becherförmig (Song und Jung, unveröffentlichte Daten).
Die zelluläre Internalisierung von BV2-abgeleiteten Exosomen in menschliche U87-Gliomzellen wurde mithilfe konfokaler Mikroskopie beobachtet.PKH26-markierte Exosomen sind im Zytoplasma von U87-Zellen lokalisiert.Die Kerne wurden mit DAPI gefärbt (Abb. 2A), was darauf hindeutet, dass von BV2 abgeleitete Exosomen von Wirtszellen internalisiert werden und die Umgebung der Empfängerzellen beeinflussen können.
Die Internalisierung von BV2-abgeleiteten Exosomen in U87-Gliomzellen und BV2-abgeleitete Exosomen, die mit Toxoplasma RH infiziert waren, induzierten die Proliferation von U87-Gliomzellen.(A) Von U87-Zellen verschlungene Exosomen, gemessen durch konfokale Mikroskopie.U87-Gliomzellen wurden mit mit PKH26 (rot) markierten Exosomen oder ohne Kontrolle 24 Stunden lang inkubiert.Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt und dann unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet (Maßstab: 10 μm, x 3000).(B) Die Proliferation von U87-Gliomzellen wurde durch einen Zellproliferationstest bestimmt.U87-Gliomzellen wurden für die angegebene Zeit mit Exosomen behandelt. *P < 0,05 wurde durch den Student-t-Test ermittelt. *P < 0,05 wurde durch den Student-t-Test ermittelt. *P < 0,05 gemäß T-Kriterium-Studenten. *P < 0,05 laut Student-T-Test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, abhängig von der T-Kriterien-Stufe. * P < 0,05, ermittelt mit dem Student-t-Test.
Nachdem wir die Internalisierung von BV2-abgeleiteten Exosomen in U87-Gliomzellen bestätigt hatten, führten wir Zellproliferationstests durch, um die Rolle von BV2-abgeleiteten Toxoplasma-abgeleiteten Exosomen bei der Entwicklung menschlicher Gliomzellen zu untersuchen.Die Behandlung von U87-Zellen mit Exosomen aus T. gondii-infizierten BV2-Zellen zeigte, dass von T. gondii infizierte BV2-abgeleitete Exosomen im Vergleich zur Kontrolle eine signifikant höhere Proliferation von U87-Zellen verursachten (Abb. 2B).
Darüber hinaus hatte das Wachstum von U118-Zellen die gleichen Ergebnisse wie das von U87, da durch Toxoplasma stimulierte Exosomen die höchsten Proliferationsraten verursachten (Daten nicht gezeigt).Basierend auf diesen Daten können wir darauf hinweisen, dass von BV2 abgeleitete, mit Toxoplasma infizierte Exosomen eine wichtige Rolle bei der Proliferation von Gliomzellen spielen.
Um die Wirkung von Toxoplasma-infizierten BV2-abgeleiteten Exosomen auf die Tumorentwicklung zu untersuchen, injizierten wir für ein Xenotransplantatmodell U87-Gliomzellen in Nacktmäuse und injizierten BV2-abgeleitete Exosomen oder RH-infizierte BV2-abgeleitete Exosomen.Nachdem nach einer Woche Tumore sichtbar wurden, wurde jede Versuchsgruppe von 5 Mäusen entsprechend der Tumorgröße aufgeteilt, um denselben Ausgangspunkt zu bestimmen, und die Tumorgröße wurde 22 Tage lang gemessen.
Bei Mäusen mit dem U87-Xenotransplantatmodell wurden am 22. Tag in der von BV2 abgeleiteten RH-infizierten Exosomengruppe eine signifikant größere Tumorgröße und ein signifikant größeres Tumorgewicht beobachtet (Abb. 3A, B).Andererseits gab es nach der Exosomenbehandlung keinen signifikanten Unterschied in der Tumorgröße zwischen der BV2-abgeleiteten Exosomengruppe und der Kontrollgruppe.Darüber hinaus zeigten Mäuse, denen Gliomzellen und Exosomen injiziert wurden, visuell das größte Tumorvolumen in der Gruppe der RH-infizierten BV2-abgeleiteten Exosomen (Abb. 3C).Diese Ergebnisse zeigen, dass von BV2 abgeleitete, mit Toxoplasma infizierte Exosomen das Wachstum von Gliomen in einem Maustumormodell induzieren.
Onkogenese (AC) von BV2-abgeleiteten Exosomen in einem U87-Xenotransplantat-Mausmodell.Tumorgröße (A) und -gewicht (B) waren bei BALB/c-Nacktmäusen, die mit von BV2 abgeleiteten RH-infizierten Exosomen behandelt wurden, signifikant erhöht.BALB/c-Nacktmäusen (C) wurden 1 x 107 U87-Zellen, suspendiert in einer Matrigel-Mischung, subkutan injiziert.Sechs Tage nach der Injektion wurden Mäuse mit 100 μg BV2-abgeleiteten Exosomen behandelt.Tumorgröße und -gewicht wurden an den angegebenen Tagen bzw. nach der Tötung gemessen. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05。 *P < 0,05。 *Р < 0,05. *P < 0,05.
Die Daten zeigten, dass 37 miRNAs (16 überexprimiert und 21 herunterexprimiert), die mit Immunität oder Tumorentwicklung in Zusammenhang stehen, in Mikroglia nach einer Infektion mit dem Toxoplasma-RH-Stamm signifikant verändert waren (Abb. 4A).Die relativen Expressionsniveaus von miR-21 unter veränderten miRNAs wurden durch Echtzeit-RT-PCR in von BV2 abgeleiteten Exosomen, mit BV2 behandelten Exosomen und U87-Zellen bestätigt.Die Expression von miR-21 zeigte einen signifikanten Anstieg der Exosomen von BV2-Zellen, die mit Toxoplasma gondii (RH-Stamm) infiziert waren (Abb. 4B).Die relativen Expressionsniveaus von miR-21 in BV2- und U87-Zellen stiegen nach Aufnahme veränderter Exosomen (Abb. 4B).Die relativen Ausmaße der miR-21-Expression im Gehirngewebe von Tumorpatienten und Mäusen, die mit Toxoplasma gondii (Stamm ME49) infiziert waren, waren jeweils höher als bei den Kontrollen (Abb. 4C).Diese Ergebnisse korrelieren mit Unterschieden zwischen den Expressionsniveaus vorhergesagter und bestätigter microRNAs in vitro und in vivo.
Veränderungen in der Expression von exosomalem miP-21a-5p in mit Toxoplasma gondii (RH) infizierten Mikroglia.(A) Zeigt signifikante Veränderungen der siRNA im Zusammenhang mit Immunität oder Tumorentwicklung nach einer T. gondii RH-Infektion.(B) Relative miR-21-Expressionsniveaus wurden durch Echtzeit-RT-PCR in BV2-abgeleiteten Exosomen, BV2-behandelten Exosomen und U87-Zellen nachgewiesen.(C) Relative miR-21-Expressionsniveaus wurden im Gehirngewebe von Tumorpatienten (N=3) und mit Toxoplasma gondii (Stamm ME49) infizierten Mäusen (N=3) gefunden. *P < 0,05 wurde durch den Student-t-Test ermittelt. *P < 0,05 wurde durch den Student-t-Test ermittelt. *P < 0,05 wurde aufgrund der T-Kriterien-Stufe erhöht. *P < 0,05 wurde mithilfe des Student-t-Tests ermittelt. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, abhängig von der T-Kriterien-Stufe. * P < 0,05, ermittelt mit dem Student-t-Test.
Exosomen aus RH-infizierten BV2-Zellen führten in vivo und in vitro zum Wachstum von Gliomen (Abb. 2, 3).Um relevante mRNAs zu erkennen, untersuchten wir die mRNA-Spiegel von Antitumor-Zielgenen, Forkhead Box O1 (FoxO1), PTEN und programmiertem Zelltod 4 (PDCD4) in U87-Zellen, die mit von BV2 oder RH BV2 abgeleiteten Exosomen infiziert waren.Bioinformatische Analysen haben gezeigt, dass mehrere tumorassoziierte Gene, darunter die Gene FoxO1, PTEN und PDCD4, miR-2121,22-Bindungsstellen aufweisen.Die mRNA-Spiegel von Antitumor-Zielgenen waren in RH-infizierten, von BV2 abgeleiteten Exosomen im Vergleich zu von BV2 abgeleiteten Exosomen verringert (Abb. 5A).FoxO1 zeigte verringerte Proteinspiegel in RH-infizierten, von BV2 abgeleiteten Exosomen im Vergleich zu von BV2 abgeleiteten Exosomen (Abbildung 5B).Basierend auf diesen Ergebnissen konnten wir bestätigen, dass Exosomen, die von RH-infiziertem BV2 stammen, antionkogene Gene herunterregulieren und so ihre Rolle beim Tumorwachstum beibehalten.
Mit Toxoplasma RH infizierte, von BV2 abgeleitete Exosomen induzieren die Unterdrückung von Antitumorgenen in U87-Gliomzellen durch mit Toxoplasma RH infizierte, von BV2 abgeleitete Exosomen.(A) Echtzeit-PCR der FoxO1-, PTEN- und PDCD4-Expression in Exosomen, die von mit T. gondii RH infizierten BV2 stammen, im Vergleich zu PBS-Exosomen.Als Kontrolle wurde β-Actin-mRNA verwendet.(B) Die FoxO1-Expression wurde durch Western Blot bestimmt und Densitometriedaten wurden mit dem ImageJ-Programm statistisch ausgewertet. *P < 0,05 wurde durch den Student-t-Test ermittelt. *P < 0,05 wurde durch den Student-t-Test ermittelt. *P < 0,05 wurde aufgrund der T-Kriterien-Stufe erhöht. *P < 0,05 wurde mithilfe des Student-t-Tests ermittelt. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, abhängig von der T-Kriterien-Stufe. * P < 0,05, ermittelt mit dem Student-t-Test.
Um die Wirkung von miP-21 in Exosomen auf die tumorassoziierte Genregulation zu verstehen, wurden U87-Zellen mit einem Inhibitor von miP-21 unter Verwendung von Lipofectamine 2000 transfiziert und die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion geerntet.Die Expressionsniveaus von FoxO1 und p27 in mit miR-21-Inhibitoren transfizierten Zellen wurden mithilfe von qRT-PCR mit Zellen verglichen, die mit von BV2 abgeleiteten Exosomen behandelt wurden (Abb. 6A, B).Durch die Transfektion des miR-21-Inhibitors in U87-Zellen wurde die FoxO1- und p27-Expression deutlich herunterreguliert (Abb. 6).
RH-infiziertes exosomales BV2-abgeleitetes miP-21 veränderte die FoxO1/p27-Expression in U87-Gliomzellen.U87-Zellen wurden unter Verwendung von Lipofectamine 2000 mit miP-21-Inhibitor transfiziert und die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion geerntet.Die Expressionsniveaus von FoxO1 und p27 in mit miR-21-Inhibitoren transfizierten Zellen wurden mithilfe von qRT-PCR (A, B) mit den Niveaus in Zellen verglichen, die mit von BV2 abgeleiteten Exosomen behandelt wurden.
Um der Immunantwort des Wirts zu entkommen, verwandelt sich der Parasit Toxoplasma in eine Gewebezyste.Sie parasitieren während der gesamten Lebenszeit des Wirts in verschiedenen Geweben, darunter Gehirn, Herz und Skelettmuskel, und modulieren die Immunantwort des Wirts.Darüber hinaus können sie den Zellzyklus und die Apoptose von Wirtszellen regulieren und so deren Proliferation fördern14,24.Toxoplasma gondii infiziert vorwiegend dendritische Zellen, Neutrophile und Monozyten-/Makrophagen-Linien des Wirts, einschließlich Mikroglia im Gehirn.Toxoplasma gondii induziert die Differenzierung von Makrophagen des M2-Phänotyps, beeinflusst die Wundheilung nach einer Pathogeninfektion und ist außerdem mit Hypervaskularisation und granulomatöser Fibrose verbunden.Diese Verhaltenspathogenese einer Toxoplasma-Infektion kann mit Markern zusammenhängen, die mit der Tumorentwicklung assoziiert sind.Die durch Toxoplasma regulierte feindliche Umgebung ähnelt möglicherweise der entsprechenden Krebsvorstufe.Daher ist davon auszugehen, dass eine Toxoplasma-Infektion zur Entstehung von Hirntumoren beitragen dürfte.Tatsächlich wurde über hohe Raten von Toxoplasma-Infektionen im Serum von Patienten mit verschiedenen Hirntumoren berichtet.Darüber hinaus kann Toxoplasma gondii ein weiterer krebserregender Effektor sein und synergetisch wirken, um anderen infektiösen Karzinogenen bei der Entwicklung von Hirntumoren zu helfen.In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass P. falciparum und das Epstein-Barr-Virus synergistisch zur Entstehung des Burkitt-Lymphoms beitragen.
Die Rolle von Exosomen als Regulatoren im Bereich der Krebsforschung wurde ausführlich untersucht.Allerdings ist die Rolle von Exosomen zwischen Parasiten und infizierten Wirten noch immer kaum verstanden.Bisher haben verschiedene Regulatoren, darunter auch sekretierte Proteine, die biologischen Prozesse erklärt, durch die Protozoen-Parasiten Wirtsangriffen widerstehen und Infektionen aufrechterhalten.In letzter Zeit wächst die Vorstellung, dass Protozoen-assoziierte Mikrovesikel und ihre microRNAs mit Wirtszellen interagieren, um eine günstige Umgebung für ihr Überleben zu schaffen.Daher sind weitere Studien erforderlich, um den Zusammenhang zwischen veränderten exosomalen miRNAs und der Proliferation von Gliomzellen herauszufinden.Die MicroRNA-Veränderung (Clustergene miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 und miR-17-92) bindet an den STAT3-Promotor in Toxoplasma-infizierten menschlichen Makrophagen, wird reguliert und induziert Anti -Apoptose als Reaktion auf eine Infektion mit Toxoplasma gondii 29 .Eine Toxoplasma-Infektion erhöht die Expression von miR-17-5p und miR-106b-5p, die mit mehreren hyperproliferativen Erkrankungen assoziiert sind 30 .Diese Daten legen nahe, dass miRNAs des Wirts, die durch eine Toxoplasma-Infektion reguliert werden, wichtige Moleküle für das Überleben des Parasiten und die Pathogenese im biologischen Verhalten des Wirts sind.
Veränderte miRNAs können verschiedene Verhaltensweisen während der Entstehung und Progression bösartiger Zellen, einschließlich Gliomen, beeinflussen: Selbstversorgung mit Wachstumssignalen, Unempfindlichkeit gegenüber wachstumshemmenden Signalen, Umgehung der Apoptose, unbegrenztes Replikationspotential, Angiogenese, Invasion und Metastasierung sowie Entzündung.Bei Gliomen wurden in mehreren Expressionsprofilierungsstudien veränderte miRNAs identifiziert.
In der vorliegenden Studie haben wir ein hohes Maß an miRNA-21-Expression in Toxoplasma-infizierten Wirtszellen bestätigt.miR-21 wurde als eine der am häufigsten überexprimierten microRNAs in soliden Tumoren, einschließlich Gliomen, identifiziert 33 und seine Expression korreliert mit dem Grad des Glioms.Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass miR-21 ein neuartiges Onkogen ist, das als anti-apoptotischer Faktor beim Gliomwachstum wirkt und in Geweben und Plasma maligner Erkrankungen des menschlichen Gehirns stark überexprimiert wird.Interessanterweise löst die Inaktivierung von miR-21 in Gliomzellen und -geweben die Hemmung der Zellproliferation aufgrund der Caspase-abhängigen Apoptose aus.Die bioinformatische Analyse der vorhergesagten miR-21-Ziele ergab mehrere Tumorsuppressorgene, die mit Apoptosewegen assoziiert sind, darunter programmierter Zelltod 4 (PDCD4), Tropomyosin (TPM1), PTEN und Forkhead Box O1 (FoxO1), mit der miR-2121-Bindungsstelle..22.38.
FoxO1 ist als einer der Transkriptionsfaktoren (FoxO) an der Entstehung verschiedener Krebsarten beim Menschen beteiligt und kann die Expression von Tumorsuppressorgenen wie p21, p27, Bim und FasL40 regulieren.FoxO1 kann Zellzyklusinhibitoren wie p27 binden und aktivieren, um das Zellwachstum zu unterdrücken.Darüber hinaus ist FoxO1 ein wichtiger Effektor der PI3K/Akt-Signalübertragung und reguliert viele biologische Prozesse wie das Fortschreiten des Zellzyklus und die Zelldifferenzierung durch Aktivierung der p2742-Transkription.
Zusammenfassend glauben wir, dass exosomales miR-21, das aus mit Toxoplasma infizierten Mikroglia stammt, eine wichtige Rolle als Wachstumsregulator von Gliomzellen spielen könnte (Abb. 7).Allerdings sind weitere Studien erforderlich, um einen direkten Zusammenhang zwischen exosomalem miR-21, veränderter Toxoplasma-Infektion und Gliomwachstum zu finden.Es wird erwartet, dass diese Ergebnisse einen Ausgangspunkt für die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen einer Toxoplasma-Infektion und der Inzidenz von Gliomen darstellen.
In dieser Studie wird ein schematisches Diagramm des Mechanismus der Karzinogenese von Gliomen (Gehirn) vorgeschlagen.Der Autor zeichnet in PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alle Versuchsprotokolle in dieser Studie, einschließlich der Verwendung von Tieren, entsprachen den ethischen Standardrichtlinien des Seoul National University Animal Care and User Committee und wurden vom Institutional Review Board der Seoul National University School of Medicine (IRB-Nummer SNU-) genehmigt. 150715).-2).Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den ARRIVE-Empfehlungen durchgeführt.
BV2-Maus-Mikroglia und menschliche U87-Gliomzellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) bzw. Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene) kultiviert, die jeweils 10 % fötales Rinderserum, 4 mM l- Glutamin, 0,2 mM Penicillin und 0,05 mM Streptomycin.Die Zellen wurden in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert.Zum Vergleich mit U87-Zellen wurde eine andere Gliomzelllinie, U118, verwendet.
Um Exosomen aus T. gondii-infizierten RH- und ME49-Stämmen zu isolieren, wurden T. gondii-Tachyzoiten (RH-Stamm) aus der Bauchhöhle von 6 Wochen alten BALB/c-Mäusen entnommen, denen 3–4 Tage zuvor eine Injektion verabreicht worden war.Tachyzoiten wurden dreimal mit PBS gewaschen und durch Zentrifugation in 40 % Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43 gereinigt.Um Tachyzoiten des Stammes ME49 zu erhalten, wurden BALB/c-Mäusen 20 Gewebezysten intraperitoneal injiziert und die Tachyzoitentransformation in Zysten wurde durch Waschen der Bauchhöhle am 6.–8. Tag nach der Infektion (PI) gesammelt.Mit PBS infizierte Mäuse.ME49-Tachyzoiten wurden in Zellen gezüchtet, die mit 100 μg/ml Penicillin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml Streptomycin (Gibco/BRL) und 5 % fötalem Rinderserum (Lonza, Walkersville, MD) ergänzt waren. .., USA) bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Nach der Kultivierung in Vero-Zellen wurden ME49-Tachyzoiten zweimal durch eine 25-Gauge-Nadel und dann durch einen 5-µm-Filter geleitet, um Trümmer und Zellen zu entfernen.Nach dem Waschen wurden die Tachyzoiten in PBS44 resuspendiert.Gewebezysten des Toxoplasma gondii-Stammes ME49 wurden durch intraperitoneale Injektion von Zysten erhalten, die aus dem Gehirn infizierter C57BL/6-Mäuse (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea) isoliert wurden.Die Gehirne von ME49-infizierten Mäusen wurden nach 3 Monaten PI entnommen und unter einem Mikroskop zerkleinert, um Zysten zu isolieren.Die infizierten Mäuse wurden unter speziellen pathogenfreien Bedingungen (SPF) an der Seoul National University School of Medicine gehalten.
Die Gesamt-RNA wurde aus BV2-abgeleiteten Exosomen, BV2-Zellen und Geweben mit dem miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers, einschließlich der Inkubationszeit für den Elutionsschritt, extrahiert.Die RNA-Konzentration wurde mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer bestimmt.Die Qualität der RNA-Microarrays wurde mit einem Agilent 2100 Bioanalysator (Agilent Technologies, Amstelveen, Niederlande) bewertet.
DMEM mit 10 % exosomenarmem FBS wurde durch Ultrazentrifugation bei 100.000 g für 16 Stunden bei 4 °C hergestellt und durch einen 0,22-µm-Filter (Nalgene, Rochester, NY, USA) filtriert.BV2-Zellen, 5 × 105, wurden in DMEM, das 10 % exosomenarmes FBS und 1 % Antibiotika enthielt, bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.Nach 24-stündiger Inkubation wurden den Zellen Tachyzoiten des Stamms RH oder ME49 (MOI = 10) zugesetzt und nicht eindringende Parasiten innerhalb einer Stunde entfernt und erneut mit DMEM aufgefüllt.Exosomen aus BV2-Zellen wurden durch modifizierte Differentialzentrifugation, die am weitesten verbreitete Methode, isoliert.Resuspendieren Sie das Exosomenpellet in 300 µl PBS für die RNA- oder Proteinanalyse.Die Konzentration isolierter Exosomen wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) und einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer bestimmt.
Präzipitate von BV2-Zellen oder von BV2 abgeleitete Exosomen wurden in PRO-PREP™-Proteinextraktionslösung (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) lysiert und Proteine ​​auf mit Coomassie-Brillantblau gefärbte 10 % SDS-Polyacrylamidgele geladen.Zusätzlich wurden Proteine ​​für 2 Stunden auf PVDF-Membranen übertragen.Western Blots wurden unter Verwendung des Alix-Antikörpers (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) als exosomaler Marker validiert.Als Sekundärantikörper wurden HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) und ein LAS-1000 plus Lumineszenzbildanalysator (Fuji Photographic Film, Tokio, Japan) verwendet..Zur Untersuchung der Größe und Morphologie von Exosomen wurde eine Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt.Aus BV2-Zellen isolierte Exosomen (6,40 µg/µl) wurden auf kohlenstoffbeschichteten Netzen präpariert und 1 Minute lang mit 2 % Uranylacetat negativ gefärbt.Die vorbereiteten Proben wurden bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV mit einem JEOL 1200-EX II (Tokio, Japan) beobachtet, das mit einer ES1000W Erlangshen CCD-Kamera (Gatan, Pleasanton, CA, USA) ausgestattet war.
Von BV2 abgeleitete Exosomen wurden mit dem PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt.U87-Zellen, 2×105, mit PKH26-markierten Exosomen (rot) oder ohne Exosomen als Negativkontrolle, wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert.U87-Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt, U87-Zellen wurden 15 Minuten lang bei 4 ° C in 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann in einem konfokalen Leica TCS SP8 STED CW-Mikroskopsystem (Leica Microsystems, Mannheim, Deutschland) analysiert.beobachtbar.
cDNA wurde aus siRNA unter Verwendung der Mir-X-siRNA-Erststrangsynthese und des SYBR-qRT-PCR-Kits (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) synthetisiert.Eine quantitative Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung des iQ5-Echtzeit-PCR-Nachweissystems (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) unter Verwendung von Primern und Templates, gemischt mit SYBR Premix, durchgeführt.Die DNA wurde über 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 s und Annealing bei 60 °C für 60 s amplifiziert.Die Daten jeder PCR-Reaktion wurden mit dem Datenanalysemodul der optischen Systemsoftware iQ™5 (Bio-Rad) analysiert.Relative Veränderungen der Genexpression zwischen ausgewählten Zielgenen und β-Actin/siRNA (und U6) wurden mithilfe der Standardkurvenmethode berechnet.Die verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
3 x 104 U87-Gliomzellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und nach 12, 18 und 36 Stunden mit Toxoplasma-infizierten Exosomen aus BV2 (50 μg/ml) oder Nicht-Puls-Exosomen aus BV2 (50 μg/ml) als Kontrollen gemischt .Die Zellproliferationsrate wurde mit dem Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) bestimmt (Ergänzende Abbildungen S1–S3) 46 .
5 Wochen alte weibliche BALB/c-Nacktmäuse wurden von Orient Bio (Seongnam-si, Südkorea) gekauft und einzeln in sterilen Käfigen bei Raumtemperatur (22 ± 2 °C) und Luftfeuchtigkeit (45 ± 15 °C) gehalten.%) bei Raumtemperatur (22 ± 2 °C) und Luftfeuchtigkeit (45 ± 15 %).Unter SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center) wurden ein 12-Stunden-Lichtzyklus und ein 12-Stunden-Dunkelzyklus durchgeführt.Die Mäuse wurden zufällig in drei Gruppen zu je 5 Mäusen aufgeteilt und allen Gruppen wurden 400 ml PBS, enthaltend 1 x 107 U87-Gliomzellen und Wachstumsfaktor-reduziertes BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA), subkutan injiziert.Sechs Tage nach der Tumorinjektion wurden 200 mg Exosomen aus BV2-Zellen (mit/ohne Toxoplasma-Infektion) in die Tumorstelle injiziert.Zweiundzwanzig Tage nach der Tumorinfektion wurde die Tumorgröße der Mäuse in jeder Gruppe dreimal pro Woche mit einem Messschieber gemessen und das Tumorvolumen nach der Formel berechnet: 0,5 × (Breite) × 2 × Länge.
MicroRNA-Expressionsanalyse mit miRCURYTM LNA-miRNA-Array der 7. Generation, mmu- und rno-Arrays (EXIQON, Vedbaek, Dänemark) für 1119 gut charakterisierte Mäuse unter 3100 menschlichen, Maus- und Ratten-miRNA-Einfangsonden.Während dieses Verfahrens wurden 250 bis 1000 ng Gesamt-RNA aus dem 5′-Phosphat durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm und anschließende Markierung mit dem grünen Fluoreszenzfarbstoff Hy3 entfernt.Die markierten Proben wurden dann durch Laden von Microarray-Objektträgern mit einem Hybridisierungskammer-Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) und einem Hybridisierungs-Objektträger-Kit (Agilent Technologies) hybridisiert.Die Hybridisierung erfolgte 16 Stunden lang bei 56 °C, anschließend wurden die Microarrays gemäß den Empfehlungen des Herstellers gewaschen.Die verarbeiteten Microarray-Objektträger wurden dann mit einem Agilent G2565CA Microarray-Scannersystem (Agilent Technologies) gescannt.Gescannte Bilder wurden mit der Agilent Feature Extraction-Software Version 10.7.3.1 (Agilent Technologies) importiert und die Fluoreszenzintensität jedes Bildes wurde mithilfe der entsprechenden GAL-Datei des modifizierten Exiqon-Protokolls quantifiziert.Microarray-Daten für die aktuelle Studie sind in der GEO-Datenbank unter der Zugangsnummer GPL32397 hinterlegt.
Expressionsprofile reifer exosomaler miRNAs in Mikroglia von mit Toxoplasma infizierten RH- oder ME49-Stämmen wurden mithilfe verschiedener Netzwerktools analysiert.Mit der Tumorentwicklung assoziierte miRNAs wurden mit miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) identifiziert und mit einer normalisierten Signalintensität (log2) von mehr als 8,0 herausgefiltert.Unter den miRNAs wurde durch Filteranalyse von miRNAs, die durch mit T. gondii infizierte RH- oder ME49-Stämme verändert wurden, festgestellt, dass differenziell exprimierte miRNAs mehr als 1,5-fach verändert waren.
Die Zellen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen (3 x 10 Zellen/Vertiefung) in opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ausgesät.Die transfizierten Zellen wurden 6 Stunden lang kultiviert und dann wurde das Medium durch frisches Komplettmedium ersetzt.Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion geerntet.
Die statistische Analyse wurde hauptsächlich mithilfe des Student-t-Tests mit Excel-Software (Microsoft, Washington, DC, USA) durchgeführt.Für die Tierversuchsanalyse wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit der Prism 3.0-Software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Genauigkeit: P <0,05. P-Werte <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Genauigkeit: P <0,05. P-Werte <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Alle in dieser Studie verwendeten Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Review Board der Seoul National University School of Medicine (IRB-Nummer SNU-150715-2) genehmigt.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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